Durchflusszytometrie Analyse von Immunzell-Subsets innerhalb der Murinenmilen, Knochenmark, Lymphknoten und Synovialgewebe in einem Osteoarthritis-Modell
Summary
Hier beschreiben wir ein detailliertes und reproduzierbares Flusszytometrieprotokoll zur Identifizierung von Monozyten-Makrophagen- und T-Zell-Subsets mit extra- und intrazellulären Färbetests innerhalb der murinen Milz, des Knochenmarks, der Lymphknoten und des Synovialgewebes unter Verwendung eines etablierten chirurgischen Modells der murinen Arthrose.
Abstract
Osteoarthritis (OA) ist eine der häufigsten Muskel-Skelett-Erkrankungen, die Patienten mit Schmerzen und körperlichen Einschränkungen betrifft. Jüngste Erkenntnisse deuten auf eine mögliche entzündliche Komponente der Krankheit hin, wobei sowohl T-Zellen als auch Monozyten/Makrophagen potenziell mit der Pathogenese von OA in Verbindung gebracht werden können. Weitere Studien postulierten eine wichtige Rolle für Teilmengen der beiden entzündlichen Zelllinien, wie Th1, Th2, Th17 und T-regulatorische Lymphozyten, und M1, M2, und Synovium-Gewebe-residenten Makrophagen. Die Wechselwirkung zwischen der lokalen synovialen und systemischen entzündlichen zellulären Reaktion und den strukturellen Veränderungen im Gelenk ist jedoch unbekannt. Um vollständig zu verstehen, wie T-Zellen und Monozyten/Makrophagen zu OA beitragen, ist es wichtig, diese Zellen und ihre Teilmengen gleichzeitig in Synovialgewebe, sekundären Lymphorganen und systemisch (Milz und Knochenmark) quantitativ identifizieren zu können. Heutzutage können die verschiedenen entzündlichen Zelluntermengen durch eine Kombination von Zell-Oberflächen-Markern identifiziert werden, was die mehrfarbige Durchflusszytometrie zu einer leistungsstarken Technik bei der Untersuchung dieser zellulären Prozesse macht. In diesem Protokoll beschreiben wir detaillierte Schritte zur Gewinnung von Synovialgewebe und sekundären lymphatischen Organen sowie zur Erzeugung von einzelzelligen Suspensionen. Darüber hinaus präsentieren wir sowohl einen extrazellulären Färbetest zur Identifizierung von Monozyten/Makrophagen und deren Teilmengen als auch einen extra- und intrazellulären Färbetest zur Identifizierung von T-Zellen und deren Teilmengen innerhalb der murinen Milz, des Knochenmarks, der Lymphknoten und des Synovials. Jeder Schritt dieses Protokolls wurde optimiert und getestet, was zu einem hochreproduzierbaren Assay führte, der für andere chirurgische und nicht-chirurgische OA-Mausmodelle verwendet werden kann.
Introduction
Osteoarthritis (OA) ist eine schwächende und schmerzhafte Krankheit mit verschiedenen Pathologien aller Gewebe, die mit dem Gelenk1verbunden sind. OA betrifft etwa 3,8 % der Weltbevölkerung2, OA ist eine der am weitesten verbreiteten Muskel-Skelett-Erkrankungen und es soll die4. führende Ursache von Behinderungen weltweit bis 20203werden. Posttraumatische OA tritt nach einer Gelenkverletzung auf und macht mindestens 12% aller OA und bis zu 25% der OA in anfälligen Gelenken wie dem Knie4,5aus. Darüber hinaus erhöht Gelenkverletzung das Lebenslange Risiko von OA um mehr als das Fünffachevon 6. Nicht alle Verletzungen mit scheinbar ähnlicher Instabilität werden OA entwickeln, und daher bleiben die Definition von Faktoren, die das langfristige OA-Risiko antreiben, herausfordernd. Es ist von entscheidender Bedeutung, um wirksame Behandlungen zu entwickeln, um posttraumatische OA zu verhindern und/oder zu behandeln, die verletzungsspezifische Pathologie, Ursachen und Mechanismen zu untersuchen und besser zu definieren, die OA1prädisponieren.
OA und seine definierende Knorpelzerstörung wurde früher vollständig auf mechanische Beanspruchung zurückgeführt und oA wurde daher als nicht-entzündliche Erkrankung angesehen2. Jedoch, neuere Studien haben gezeigt, eine entzündliche Infiltration von Synovialmembranen und eine Zunahme der entzündlichen Zellen im Synovialgewebe bei Patienten mit OA im Vergleich zu gesunden Kontrollen2, Licht auf eine entzündliche Komponente als potenzielle treibende Kraft in OA. Weitere Studien zeigten, dass Anomalien sowohl im CD4+ als auch im CD8+ T-Zell-Profil sowie Monozyten/Makrophagen des angeborenen Immunsystems zur Pathogenese von OA2,7beitragen können. Detaillierte Untersuchungen dieser Anomalien ergaben relevante Rollen für verschiedene T-Zell-Teilmengen2, wie Th18, Th29, Th178 und T regulatorische (Treg) Populationen10,11. Trotz dieser überzeugenden Beweise ist der kausale Zusammenhang zwischen der Veränderung der T-Zell-Antworten und der Entwicklung und Progression von OA noch unbekannt2.
Zusätzlich zu bestimmten T-Zellen, die eine Rolle in OA spielen, deuten neuere Studien darauf hin, dass differenziell polarisierte/aktivierte Makrophagen mit der Pathogenese von OA12in Verbindung gebracht werden können. Insbesondere akkumulieren Makrophagen aus Blutmonozyten im Synovium und polarisieren entweder in klassisch aktivierte Makrophagen (M1) oder alternativ aktivierte Makrophagen (M2) während der OA-Entwicklung, was eine Korrelation zwischen monozytenabgeleiteten Makrophagen und OA13impliziert. Im Gegensatz dazu bevölkern bestimmte Teilmengen von Makrophagen Organe früh während der Entwicklung und unterstützen ihre Zahl in einer monozytenunabhängigen Materie14. Kürzlich wurde eine gemeinsame Schutzfunktion gezeigt, die durch eine enge Kreuzungsbarriere vermittelt wurde, für diese synovial-geweberesidenten Makrophagen (STRMs)14. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Anomalien in bestimmten Makrophagen-Teilmengen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von OA spielen können. Die Wechselwirkungen zwischen dieser entzündlichen zellulären Reaktion und den strukturellen Veränderungen im Gelenk nach dem Trauma sind jedoch unbekannt.
Historisch gesehen beschränkte sich die Analyse von Immunzellen im Synovialgewebe auf die Immunhistochemie (IHC) oder mRNA-Expression durch Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Ansätze15,16. Sowohl IHC als auch RT-PCR sind jedoch nicht in der Lage, mehrere verschiedene Zelltypen und deren Teilmengen gleichzeitig zu identifizieren, wodurch die Anwendbarkeit dieser Methoden eingeschränkt wird. Darüber hinaus beschränkt sich IHC auf die Analyse von kleinen Gewebeproben und kann fokale entzündliche Zellansammlungen verpassen. In den letzten Jahren wurden unzählige Oberflächenmarker für verschiedene Zelltypen entwickelt, und Untermengen von Immunzellen können nun durch unterschiedliche Kombinationen dieser Marker zuverlässig identifiziert werden. Aufgrund des stetigen technischen Fortschritts sind Durchflusszytometer nun in der Lage, eine Vielzahl verschiedener Fluorchrome gleichzeitig zu identifizieren, was die Analyse großer mehrfarbiger Antikörperplatten ermöglicht.
Die Durchflusszytometrie bietet den Forschern eine leistungsstarke Technik, die die gleichzeitige Identifizierung und Quantifizierung einer Vielzahl von Immunzellen und deren Teilmengen auf Einzelzellebene ermöglicht. Wir haben sowohl einen extrazellulären Färbetest zur Identifizierung von Monozyten/Makrophagen und deren Teilmengen als auch einen extra-intrazellulären Färbetest entwickelt und optimiert, um T-Zellen und ihre Untergruppen in muriner Milz, Knochenmark, Lymphknoten und Synovialgewebe zu identifizieren. Jeder Schritt dieses Protokolls wurde optimiert und getestet, was zu einem hochreproduzierbaren Assay führte, der für andere chirurgische und nicht-chirurgische OA-Mausmodelle17verwendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden entwickelt und getestet, um verschiedene Teilmengen sowohl aus Monozyten/Makrophagen als auch aus T-Zellen innerhalb der murinen Milz, des Knochenmarks, der Lymphknoten und des Synovialgewebes in einem murinen Modell der Arthrose (OA) zuverlässig zu identifizieren. Das aktuelle Protokoll kann leicht geändert werden, um verschiedene Gewebetypen oder andere Zelltypen durch Austausch von Antikörpern zu untersuchen, und kann für alternative murine Modelle von OA verwe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Andrew Lim, Ph.D. und Giles Best, Ph.D. für ihre Hilfe beim Aufbau des Durchflusszytometers. Unterstützt wurde das Projekt von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) an die PH.
Materials
| APC anti-mouse CD194 (CCR4) | BioLegend | 131212 | T-Cell Panel | |
| Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst | BD | 566385 | Buffers | |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | T-Cell Panel | |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | Monocyte Panel | |
| Liberase, Research Grade | Roche | 5401127001 | Enzyme for synovial tissue | |
| Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg | BD | 564985 | Monocyte Panel | |
| Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg | BD | 562454 | Monocyte Panel | |
| Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg | BD | 742274 | T-Cell Panel | |
| Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg | BD | 565250 | Monocyte Panel | |
| Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg | BD | 563061 | T-Cell Panel | |
| Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg | BD | 557596 | T-Cell Panel | |
| Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg | BD | 552775 | T-Cell Panel | |
| Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg | BD | 565480 | T-Cell Panel | |
| Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg | BD | 565261 | T-Cell Panel | |
| Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg | BD | 740664 | T-Cell Panel | |
| Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg | BD | 563687 | Monocyte Panel | |
| Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg | BD | 563332 | T-Cell Panel | |
| Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg | BD | 565411 | Monocyte Panel | |
| Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg | BD | 560408 | T-Cell Panel | |
| Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg | BD | 563414 | Monocyte Panel | |
| Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg | BD | 560593 | Monocyte Panel | |
| Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg | BD | 560600 | Monocyte Panel | |
| Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg | BD | 564143 | T-Cell Panel | |
| Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg | BD | 562894 | T-Cell Panel | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | N/A | N/A | Buffers | Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): . |
| Transcription Factor Buffer Set 100Tst | BD | 562574 | Buffers |
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