Flow Cytometrie Analyse van immune cell subsets binnen de Murine Milt, Beenmerg, lymfeklieren en synoviale weefsel in een artrose model
Summary
Hier beschrijven we een gedetailleerd en reproduceerbaar stroomcytometrieprotocol om monocyten/macrofaag en T-celsubsets te identificeren met behulp van zowel extra- als intracellulaire kleuringstesten in de murine milt, beenmerg, lymfeklieren en synovaal weefsel, gebruikmakend van een gevestigd chirurgisch model van murineartrose.
Abstract
Artrose (OA) is een van de meest voorkomende aandoeningen van het bewegingsapparaat, die patiënten die lijden aan pijn en lichamelijke beperkingen. Recent bewijs wijst op een potentiële ontstekingscomponent van de ziekte, met zowel T-cellen als monocyten/macrofagen die mogelijk geassocieerd kunnen worden met de pathogenese van OA. Verdere studies postuleerden een belangrijke rol voor subsets van beide inflammatoire cellijnen, zoals Th1, Th2, Th17 en T-regulerende lymfocyten, en M1, M2 en synovium-weefsel-resident macrofagen. De interactie tussen de lokale synoviale en systemische ontstekingscellulaire respons en de structurele veranderingen in het gewricht is echter onbekend. Om volledig te begrijpen hoe T-cellen en monocyten/macrofagen bijdragen aan OA, is het belangrijk om deze cellen en hun subsets gelijktijdig te kunnen identificeren in synoviale weefsel, secundaire lymfeorganen en systemisch (de milt en het beenmerg). Tegenwoordig kunnen de verschillende inflammatoire celsubsets worden geïdentificeerd door een combinatie van celoppervlaktemarkers die multi-color flow cytometrie maken tot een krachtige techniek bij het onderzoeken van deze cellulaire processen. In dit protocol beschrijven we gedetailleerde stappen met betrekking tot de oogst van synoviale weefsel en secundaire lymfeorganen en het genereren van eencellige suspensies. Verder presenteren we zowel een extracellulaire kleurtest om monocyten / macrofagen en hun subsets te identificeren, als een extra- en intracellulaire kleurtest om T-cellen en hun subsets te identificeren in de murine milt, beenmerg, lymfeklieren en synoviale weefsel. Elke stap van dit protocol werd geoptimaliseerd en getest, wat resulteert in een zeer reproduceerbare test die kan worden gebruikt voor andere chirurgische en niet-chirurgische OA-muismodellen.
Introduction
Artrose (OA) is een slopende en pijnlijke ziekte waarbij verschillende pathologieën van alle weefsels geassocieerd met het gewricht1. Het beïnvloeden van ongeveer 3,8% van de wereldbevolking2, OA is een van de meest voorkomende spier- en skeletaandoeningen en het is om de4e belangrijkste oorzaak van invaliditeit wereldwijd in 20203. Posttraumatische OA treedt op na een gewrichtsletsel en is goed voor ten minste 12% van alle OA en tot 25% van OA in gevoelige gewrichten zoals de knie4,5. Bovendien verhoogt gewrichtsletsel het levensrisico van OA met meer dan vijf keer6. Niet alle verwondingen met schijnbaar vergelijkbare instabiliteit zal gaan om OA te ontwikkelen, en dus het definiëren van factoren die rijden de lange termijn OA-risico blijft een uitdaging. Het is van cruciaal belang om effectieve behandelingen te ontwikkelen om posttraumatische OA te voorkomen en/of te behandelen, om de letselspecifieke pathologie, oorzaken en mechanismen die vatbaar zijn voor OA1te onderzoeken en beter te definiëren.
OA en de bepalende vernietiging van kraakbeen werden voorheen volledig toegeschreven aan mechanische stress en dus werd OA beschouwd als een niet-inflammatoire ziekte2. Recentere studies hebben echter een ontstekingsinfiltratie van synoviale membranen en een toename van ontstekingscellen in het synoviale weefsel bij patiënten met OA aangetoond in vergelijking met gezonde controles2, licht werpen op een ontstekingscomponent als een potentiële drijvende kracht in OA. Verdere studies wezen uit dat afwijkingen in zowel het CD4+ als cd8+ T-celprofiel en monocyten/macrofagen van het aangeboren immuunsysteem kunnen bijdragen tot de pathogenese van OA2,7. Gedetailleerde onderzoeken naar deze afwijkingen toonden relevante rollen aan voor verschillende T-celsubsets2, zoals1 8th2 ,Th2 9, Th178 en T regulatory (Treg) populaties10,11. Ondanks dit overtuigende bewijs is het oorzakelijk verband tussen de wijziging van T-celreacties en de ontwikkeling en progressie van OA nog onbekend2.
Naast specifieke T-cellen die een rol spelen in OA, suggereren recente studies dat gedifferentieerd/geactiveerde macrofagen geassocieerd kunnen worden met pathogenese van OA12. In het bijzonder accumuleren macrofagen afkomstig van bloedmonocyten in het synovium en polariseren in klassiek geactiveerde macrofagen (M1) of als alternatief geactiveerde macrofagen (M2) tijdens de OA-ontwikkeling, wat een correlatie impliceert tussen monocyt afgeleide macrofagen en OA13. In tegenstelling, sommige subsets van macrofagen bevolken organen vroeg tijdens de ontwikkeling en zelf-ondersteunen hun nummers in een monocyten onafhankelijke materie14. Onlangs werd een gewrichtsbeschermende functie getoond die werd bemiddeld door een strakke barrière voor deze synoviale weefsel-ingezetene macrofagen (STRMs)14. Deze bevindingen wijzen erop dat afwijkingen in met name subsets van macrofagen een cruciale rol kunnen spelen bij de ontwikkeling van OA. De interacties tussen deze ontstekingscellulaire respons en de structurele veranderingen in het gewricht na trauma zijn echter onbekend.
Historisch gezien was de analyse van immuuncellen in het synoviale weefsel beperkt tot immunohistochemie (IHC) of mRNA-expressie door reverse-transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR) benaderingen15,16. Zowel IHC als RT-PCR missen echter de mogelijkheid om meerdere verschillende celtypen en hun subsets tegelijkertijd te identificeren, waardoor de toepasbaarheid van deze methoden wordt beperkt. Bovendien is IHC beperkt tot analyse van kleine monsters van weefsel en kan focale ontstekingscelophopingen missen. In de afgelopen jaren zijn een groot aantal oppervlaktemarkers voor verschillende celtypen ontwikkeld, en subsets van immuuncellen kunnen nu betrouwbaar worden geïdentificeerd door verschillende combinaties van deze markers. Als gevolg van gestage technische vooruitgang, stroom cytometers zijn nu in staat het identificeren van een veelheid van verschillende fluorchromen tegelijkertijd waardoor de analyse van grote veelkleurige antilichaam panelen.
Flow cytometrie biedt onderzoekers een krachtige techniek die gelijktijdige identificatie en kwantificering van een veelheid van immuuncellen en hun subsets op het niveau van eencellige mogelijk maakt. We hebben zowel een extracellulaire kleurtest ontwikkeld en geoptimaliseerd om monocyten/macrofagen en hun subsets te identificeren, evenals een extra/intracellulaire kleuringstest om T-cellen en hun subsets te identificeren in murine milt, beenmerg, lymfeklieren en synovial weefsel. Elke stap van dit protocol werd geoptimaliseerd en getest wat resulteert in een zeer reproduceerbare test die kan worden gebruikt voor andere chirurgische en niet-chirurgische OA muismodellen17.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methoden beschreven in dit protocol zijn ontworpen en getest om betrouwbaar te identificeren verschillende subsets van zowel monocyten / macrofagen en T-cellen binnen de murine milt, beenmerg, lymfeklieren, en synoviale weefsel in een murine model van artrose (OA). Het huidige protocol kan eenvoudig worden gewijzigd om verschillende weefseltypen, of andere celtypen te onderzoeken door antilichamen uit te wisselen, en kan worden gebruikt voor alternatieve murinemodellen van OA. Bij het testen van andere weefseltypen is…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Andrew Lim, Ph.D. en Giles Best, Ph.D. bedanken voor hun hulp bij het opzetten van de flow cytometer. Dit project werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) toegekend aan PH.
Materials
| APC anti-mouse CD194 (CCR4) | BioLegend | 131212 | T-Cell Panel | |
| Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst | BD | 566385 | Buffers | |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | T-Cell Panel | |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | Monocyte Panel | |
| Liberase, Research Grade | Roche | 5401127001 | Enzyme for synovial tissue | |
| Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg | BD | 564985 | Monocyte Panel | |
| Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg | BD | 562454 | Monocyte Panel | |
| Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg | BD | 742274 | T-Cell Panel | |
| Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg | BD | 565250 | Monocyte Panel | |
| Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg | BD | 563061 | T-Cell Panel | |
| Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg | BD | 557596 | T-Cell Panel | |
| Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg | BD | 552775 | T-Cell Panel | |
| Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg | BD | 565480 | T-Cell Panel | |
| Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg | BD | 565261 | T-Cell Panel | |
| Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg | BD | 740664 | T-Cell Panel | |
| Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg | BD | 563687 | Monocyte Panel | |
| Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg | BD | 563332 | T-Cell Panel | |
| Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg | BD | 565411 | Monocyte Panel | |
| Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg | BD | 560408 | T-Cell Panel | |
| Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg | BD | 563414 | Monocyte Panel | |
| Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg | BD | 560593 | Monocyte Panel | |
| Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg | BD | 560600 | Monocyte Panel | |
| Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg | BD | 564143 | T-Cell Panel | |
| Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg | BD | 562894 | T-Cell Panel | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | N/A | N/A | Buffers | Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): . |
| Transcription Factor Buffer Set 100Tst | BD | 562574 | Buffers |
References
- Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).
- Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond. Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).
- Woolf, A. D., Pfleger, B. Burden of major musculoskeletal conditions. Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).
- Little, C. B., Hunter, D. J. Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials. Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).
- Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention. Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).
- Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).
- Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis. Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).
- Yamada, H., et al. Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints. Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).
- Sakkas, L. I., et al. T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis. Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).
- Guo, S. Y., et al. Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis. Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).
- Moradi, B., et al. CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints–analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood. Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97 (2014).
- Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees. Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).
- Zhang, H., et al. Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).
- Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572, 670-675 (2019).
- Mocellin, S., et al. Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment. Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).
- Ward, J. M., et al. Immunohistochemical markers for the rodent immune system. Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).
- Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Lorenz, J., Grassel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).
- Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
- Shi, J., et al. Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice. Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
- Zhao, J., et al. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).
- Belluzzi, E., et al. Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain. BioMed Research International. 2019, 18 (2019).
