Analyse de cytométrie de flux des sous-ensembles de cellules immunitaires dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial dans un modèle d’arthrose

Summary

Ici, nous décrivons un protocole détaillé et reproductible de cytométrie de flux pour identifier les sous-ensembles monocytes/macrophage et t-cell utilisant des essais de coloration extra- et intracellulaire dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial, utilisant un modèle chirurgical établi de l’arthrose murine.

Abstract

L’arthrose est l’une des maladies musculo-squelettiques les plus répandues, affectant les patients souffrant de douleur et de limitations physiques. Des preuves récentes indiquent un composant inflammatoire potentiel de la maladie, avec les cellules T et les monocytes/macrophages potentiellement associés à la pathogénie de l’OA. D’autres études ont postulé un rôle important pour des sous-ensembles des deux lignées cellulaires inflammatoires, telles que Th1, Th2, Th17, et lymphocytes T-régulateurs, et M1, M2, et synovium-tissu-résidents macrophages. Cependant, l’interaction entre la réponse cellulaire inflammatoire synoviale et systémique locale et les changements structurels dans l’articulation est inconnue. Pour bien comprendre comment les lymphocytes T et les monocytes/macrophages contribuent à l’arthrose, il est important de pouvoir identifier ces cellules et leurs sous-ensembles simultanément dans les tissus synoviaux, les organes lymphatiques secondaires et systémiquement (la rate et la moelle osseuse). De nos jours, les différents sous-ensembles de cellules inflammatoires peuvent être identifiés par une combinaison de marqueurs de surface cellulaire faisant de la cytométrie de flux multicolore une technique puissante dans l’étude de ces processus cellulaires. Dans ce protocole, nous décrivons des étapes détaillées concernant la récolte du tissu synovial et des organes lymphatiques secondaires ainsi que la génération de suspensions unicellulaires. En outre, nous présentons à la fois un test de coloration extracellulaire pour identifier les monocytes/macrophages et leurs sous-ensembles aussi bien qu’un test de coloration extra- et intra-cellulaire pour identifier les lymphocytes T et leurs sous-ensembles dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial. Chaque étape de ce protocole a été optimisée et testée, ce qui a donné lieu à un test hautement reproductible qui peut être utilisé pour d’autres modèles chirurgicaux et non chirurgicaux de souris OA.

Introduction

L’arthrose (OA) est une maladie débilitante et douloureuse impliquant diverses pathologies de tous les tissus associés à l’articulation¹. Affectant environ 3,8% de la population mondiale², l’arthrose est l’une des maladies musculo-squelettiques les plus répandues et elle deviendra la^4ème cause d’invalidité dans le monde d’ici 2020³. L’arthrose post-traumatique survient après une blessure articulaire et représente au moins 12 % de l’ensemble de l’arthrose et jusqu’à 25 % de l’arthrose dans les articulations sensibles comme le genou^4,,5. En outre, les lésions articulaires augmentent le risque de OA à vie de plus de cinq fois⁶. Toutes les blessures ayant une instabilité apparemment similaire ne développeront pas d’arthrose, et par conséquent, il demeure difficile de définir les facteurs qui déterminent le risque d’arthrose à long terme. Il est crucial de mettre au point des traitements efficaces pour prévenir et/ou traiter l’arthrose post-traumatique, d’étudier et de mieux définir la pathologie, les causes et les mécanismes spécifiques aux blessures qui prédisposent à l’arthrose¹.

L’arthrose et sa destruction du cartilage a été précédemment attribuée entièrement au stress mécanique et, par conséquent, l’arthrose a été considérée comme une maladie non inflammatoire². Cependant, des études plus récentes ont montré une infiltration inflammatoire des membranes synoviales et une augmentation des cellules inflammatoires dans le tissu synovial dans les patients présentant l’OA comparé aux contrôles sains^2,jetant la lumière sur un composant inflammatoire comme force motrice potentielle dans l’OA. D’autres études ont indiqué que des anomalies dans le profil de cellules T CD4+ et CD8+ ainsi que dans les monocytes/macrophages du système immunitaire inné peuvent contribuer à la pathogénie de l’OA^2,7. Des études détaillées sur ces anomalies ont révélé des rôles pertinents pour divers sous-ensembles de lymphocytes T², tels que Th1⁸, Th2⁹, Th17⁸ et T régulateur (Treg) populations^10,11. Malgré ces preuves convaincantes, la relation causale entre l’altération des réponses des lymphocytes T et le développement et la progression de l’arthrose est encore inconnue².

En plus des lymphocytes T spécifiques ayant un rôle dans l’arthrose, des études récentes suggèrent que les macrophages polarisés/activés différentiellement peuvent être associés à la pathogénie de l’OA¹². En particulier, les macrophages provenant des monocytes sanguins s’accumulent dans le synovium et se polarisent dans les macrophages à activation classique (M1) ou les macrophages activés alternativement (M2) pendant le développement de l’OA, ce qui implique une corrélation entre les macrophages dérivés des monocytes et l’OA¹³. En revanche, certains sous-ensembles de macrophages peuplent les organes tôt pendant le développement et soutiennent eux-mêmes leur nombre dans une matière indépendante monocyte¹⁴. Récemment, une fonction de protection commune médiée par une barrière à jonction serrée a été montrée pour ces macrophages synovial-tissu-résidents (STRMs)¹⁴. Ces résultats indiquent que des anomalies dans des sous-ensembles de macrophage particuliers peuvent jouer un rôle crucial pendant le développement de l’OA. Cependant, les interactions entre cette réponse cellulaire inflammatoire et les changements structurels dans l’articulation suivant le trauma sont inconnues.

Historiquement, l’analyse des cellules immunitaires dans le tissu synovial a été limitée à l’immunohistorichemisme (IHC) ou à l’expression de l’ARNm par réaction en chaîne de polymérase inverse-transcription (RT-PCR)^{approches 15,16}. Cependant, l’IHC et le RT-PCR n’ont pas la capacité d’identifier plusieurs types de cellules différents et leurs sous-ensembles simultanément, limitant ainsi l’applicabilité de ces méthodes. En outre, iHC est limitée à l’analyse de petits échantillons de tissu et peut manquer des accumulations de cellules inflammatoires focales. Au cours des dernières années, une myriade de marqueurs de surface pour divers types de cellules ont été développés, et des sous-ensembles de cellules immunitaires peuvent maintenant être identifiés de manière fiable par des combinaisons distinctes de ces marqueurs. En raison de progrès techniques réguliers, les cytomètres de flux sont maintenant capables d’identifier une multitude de fluorochromes différents permettant simultanément l’analyse de grands panneaux d’anticorps multicolores.

La cytométrie de flux fournit aux chercheurs une technique puissante qui permet l’identification simultanée et la quantification d’une multitude de cellules immunitaires et de leurs sous-ensembles au niveau des cellules uniques. Nous avons développé et optimisé à la fois un test de coloration extracellulaire pour identifier les monocytes/macrophages et leurs sous-ensembles ainsi qu’un test de coloration extra/intracellulaire pour identifier les lymphocytes T et leurs sous-ensembles dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial. Chaque étape de ce protocole a été optimisée et testée, ce qui a donné lieu à un test hautement reproductible qui peut être utilisé pour d’autres modèles chirurgicaux et non chirurgicaux de souris OA¹⁷.

Protocol

Northern Sydney Local Health District Animal Ethics Committee a approuvé toutes les procédures mentionnées dans ce protocole. Les souris sont logées et soignées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Health and Medical Research Council of Australia Revised 2010). Pour toutes les expériences 10-12-semaine-vieux, mâle C57BL/6 souris ont été utilisées. REMARQUE : Pour induire l’OA post-traumatique, la déstabilisation chirurgicale …

Representative Results

Les résultats représentatifs du panneau de sous-ensemble de monocytes et du panneau de sous-ensemble de cellules T sont décrits ci-dessous. La figure 1 illustre la stratégie hiérarchique de gating pour le panneau de sous-ensemble de monocytes sur les cellules immunitaires recueillies à partir de la moelle osseuse des animaux traités par DMM. La même stratégie a été utilisée et vérifiée dans tous les autres types de tissus. Lors de la mise en place de…

Discussion

Les méthodes décrites dans ce protocole ont été conçues et testées pour identifier de manière fiable divers sous-ensembles des monocytes/macrophages et des lymphocytes T dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques, et le tissu synovial dans un modèle murin de l’arthrose (OA). Le protocole actuel peut facilement être modifié pour étudier différents types de tissus, ou d’autres types de cellules en échangeant des anticorps, et peut être utilisé pour d’autres modèles muriniques d…

Materials

APC anti-mouse CD194 (CCR4)	BioLegend	131212	T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst	BD	566385	Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µg	BD	564406	T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µg	BD	564406	Monocyte Panel
Liberase, Research Grade	Roche	5401127001	Enzyme for synovial tissue
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg	BD	564985	Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg	BD	562454	Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg	BD	742274	T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg	BD	565250	Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg	BD	563061	T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg	BD	557596	T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg	BD	552775	T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg	BD	565480	T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg	BD	565261	T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg	BD	740664	T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg	BD	563687	Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg	BD	563332	T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg	BD	565411	Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg	BD	560408	T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg	BD	563414	Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg	BD	560593	Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg	BD	560600	Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg	BD	564143	T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg	BD	562894	T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing Buffer	N/A	N/A	Buffers	Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .
Transcription Factor Buffer Set 100Tst	BD	562574	Buffers