एक ऑस्टियोआर्थराइटिस मॉडल में मुरीन स्प्लेन, बोन मैरो, लिम्फ नोड्स और सिनोवियल ऊतक के भीतर प्रतिरक्षा सेल सबसेट का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण
Summary
यहां, हम मुरीन ऑस्टियोआर्थराइटिस के एक स्थापित सर्जिकल मॉडल का उपयोग करते हुए, मुरीन तिल्ली, बोन मैरो, लिम्फ नोड्स और सिनोवियल ऊतक के भीतर अतिरिक्त और इंट्रासेलुलर स्टेनिंग परख का उपयोग करके मोनोसाइट/मैक्रोफेज और टी-सेल सबसेट की पहचान करने के लिए एक विस्तृत और प्रजनन योग्य प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) सबसे प्रचलित मस्कुलोस्केलेटल बीमारियों में से एक है, जो दर्द और शारीरिक सीमाओं से पीड़ित रोगियों को प्रभावित करता है। हाल के साक्ष्य रोग के संभावित भड़काऊ घटक को इंगित करता है, जिसमें टी-कोशिकाएं और मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज संभावित रूप से ओए के रोगजनन से जुड़े होते हैं । इसके अलावा अध्ययनों ने दोनों भड़काऊ सेल वंशों के सबसेट के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई, जैसे Th1, Th2, Th17, और टी-नियामक लिम्फोसाइट्स, और M1, M2, और सिनोवियम-ऊतक-निवासी मैक्रोफेज। हालांकि, स्थानीय सिनोवियल और प्रणालीगत भड़काऊ सेलुलर प्रतिक्रिया और संयुक्त में संरचनात्मक परिवर्तन के बीच बातचीत अज्ञात है। पूरी तरह से समझने के लिए कैसे टी कोशिकाओं और मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज OA की ओर योगदान करते हैं, यह महत्वपूर्ण है कि इन कोशिकाओं और उनके सबसेट को एक साथ सिनोवियल ऊतक, माध्यमिक लसीका अंगों और प्रणालीगत (तिल्ली और अस्थि मज्जा) में पहचान करने में सक्षम होना चाहिए । आजकल, विभिन्न भड़काऊ सेल सबसेट सेल-सतह मार्कर के संयोजन से पहचाना जा सकता है जो इन सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच में बहु-रंग प्रवाह साइटोमेट्री को एक शक्तिशाली तकनीक बनाते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम सिनोवियल ऊतक और माध्यमिक लसीका अंगों की फसल के साथ-साथ एकल कोशिका निलंबन की पीढ़ी के बारे में विस्तृत कदमों का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज और उनके सबसेट के साथ-साथ एक अतिरिक्त और इंट्रा-सेलुलर धुंधला परख की पहचान करने के लिए एक बाह्य रूप से एक बाहुल्य धुंधला परख दोनों को पेश करते हैं ताकि टी-कोशिकाओं और उनके सबसेट की पहचान की जा सके। इस प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण को अनुकूलित और परीक्षण किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप एक अत्यधिक प्रजनन योग्य परख होती है जिसका उपयोग अन्य सर्जिकल और गैर-सर्जिकल ओए माउस मॉडल के लिए किया जा सकता है।
Introduction
ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) एक दुर्बल और दर्दनाक बीमारी है जिसमें संयुक्त1से जुड़े सभी ऊतकों की विभिन्न विकृतियों को शामिल किया गया है। वैश्विक जनसंख्या का लगभग 3.8% प्रभावित करना2, ओए सबसे प्रचलित मस्कुलोस्केलेटल रोगों में से एक है और यह 20203 तक दुनिया भर में विकलांगता का चौथा प्रमुख कारण बन गया है।3 पोस्ट-ट्रॉमेटिक ओए संयुक्त चोट के बाद होता है और सभी ओए के कम से कम 12% और घुटने4,,5 जैसे अतिसंवेदनशील जोड़ों में ओए के25%तक के लिए खाते हैं। इसके अलावा, संयुक्त चोट ओए के आजीवन जोखिम को पांच गुना से अधिक6से बढ़ाती है। नहीं जाहिरा तौर पर इसी तरह की अस्थिरता के साथ सभी चोटों के लिए OA विकसित करने पर जाना होगा, और इसलिए कारकों है कि ड्राइव दीर्घकालिक OA जोखिम चुनौतीपूर्ण रहता है परिभाषित । यह महत्वपूर्ण है ताकि रोकने के लिए प्रभावी उपचार विकसित करने के लिए और/या पोस्ट दर्दनाक OA का इलाज, जांच और बेहतर चोट विशिष्ट विकृति, कारणों को परिभाषित करने के लिए, और तंत्र है किOA 1के लिए संवेदनशील ।
ओए और इसके परिभाषित उपास्थि विनाश को पहले पूरी तरह से यांत्रिक तनाव के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था और इस प्रकार, ओए को एक गैर-भड़काऊ रोग माना जाता था2। हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि सिनोवियल झिल्ली की भड़काऊ घुसपैठ और स्वस्थ नियंत्रण2की तुलना में ओए के साथ रोगियों में सिनोवियल ऊतक में भड़काऊ कोशिकाओं की वृद्धि, ओए में संभावित ड्राइविंग बल के रूप में एक भड़काऊ घटक पर प्रकाश बहा रही है। आगे के अध्ययनों से पता चला है कि सीडी 4 + और सीडी 8 + टी-सेल प्रोफाइल के साथ-साथ जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज दोनों में असामान्यताएं ओए2,,7के रोगजनन में योगदान दे सकती हैं । इन असामान्यताओं की विस्तृत जांच से विभिन्न टी सेल सबसेट2, जैसे Th18, Th29,Th17 8 और टी रेगुलेटरी (ट्रेग)आबादी 10,11केलिए प्रासंगिक भूमिकाओं का पता चला । इस सम्मोहक सबूत के बावजूद, टी-सेल प्रतिक्रियाओं के परिवर्तन और ओए के विकास और प्रगति के बीच कारण संबंध अभी भी अज्ञात2है।
ओए में भूमिका रखने वाली विशिष्ट टी-कोशिकाओं के अलावा, हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि अंतर से ध्रुवीकृत/सक्रिय मैक्रोफेज ओए12के रोगजनन के साथ जुड़े हो सकते हैं । विशेष रूप से, रक्त मोनोसाइट्स से निकलने वाले मैक्रोफेज सिनोवियम में जमा होते हैं और ओए विकास के दौरान शास्त्रीय रूप से सक्रिय मैक्रोफेज (एम 1) या वैकल्पिक रूप से सक्रिय मैक्रोफेज (एम 2) में ध्रुवित होते हैं, जिसका अर्थ है मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज और ओए13के बीच एक संबंध। इसके विपरीत, मैक्रोफेज के कुछ सबसेट विकास के दौरान जल्दी अंगों को पॉप्युलेट करते हैं और मोनोसाइट स्वतंत्र मामले14में अपनी संख्या को स्वयं बनाए रखते हैं। हाल ही में, इन सिनोवियल-टिश्यू-रेजिडेंट मैक्रोफेज (एसटीआरएमएस)14के लिए एक तंग-जंक्शन बैरियर द्वारा मध्यस्थता किए गए एक संयुक्त सुरक्षात्मक समारोह को दिखाया गया था। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि ओए के विकास के दौरान विशेष मैक्रोफेज सबसेट में असामान्यताएं महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती हैं । हालांकि, इस भड़काऊ सेलुलर प्रतिक्रिया और आघात के बाद संयुक्त में संरचनात्मक परिवर्तन के बीच बातचीत अज्ञात है ।
ऐतिहासिक रूप से, सिनोवियल ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) या एमआरएनए अभिव्यक्ति तक सीमित था, जो रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर)द्वारा 15,,16तक पहुंचता है। हालांकि, आईएचसी और आरटी-पीसीआर दोनों में कई अलग-अलग सेल प्रकारों और उनके सबसेट को एक साथ पहचानने की क्षमता की कमी है, इस प्रकार, इन तरीकों की प्रयोज्यता को सीमित करना। इसके अलावा, आईएचसी ऊतक के छोटे नमूनों के विश्लेषण तक सीमित है और फोकल भड़काऊ सेल संचय को याद कर सकता है। पिछले कई वर्षों में, विभिन्न सेल प्रकारों के लिए सतह मार्कर के असंख्य विकसित किए गए हैं, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सबसेट अब मज़बूती से इन मार्कर के अलग संयोजनों द्वारा पहचाना जा सकता है। स्थिर तकनीकी प्रगति के कारण, फ्लो साइटोमीटर अब विभिन्न फ्लोरोक्रोम की एक भीड़ की पहचान करने में सक्षम हैं जो बड़े बहुरंगी एंटीबॉडी पैनलों के विश्लेषण को सक्षम करते हैं।
फ्लो साइटोमेट्री जांचकर्ताओं को एक शक्तिशाली तकनीक प्रदान करता है जो एकल कोशिका स्तर पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं और उनके सबसेट की एक भीड़ की एक साथ पहचान और मात्राकरण की अनुमति देता है। हमने मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज और उनके सबसेट के साथ-साथ टी-कोशिकाओं और मुरीन तिल्ली, बोन मैरो, लिम्फ नोड्स और सिनोवियल ऊतक के भीतर उनके सबसेट की पहचान करने के लिए एक बाह्य धुंधला परख दोनों को विकसित और अनुकूलित किया है । इस प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण को अनुकूलित और परीक्षण किया गया जिसके परिणामस्वरूप एक अत्यधिक प्रजनन योग्य परख का उपयोग अन्य सर्जिकल और गैर-सर्जिकल ओए माउस मॉडल17के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों को डिजाइन किया गया है और मज़बूती से दोनों मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज और टी-कोशिकाओं से मुरीन तिल्ली, अस्थि मज्जा, लिम्फ नोड्स, और ओस्टियोआर्थराइटिस (ओए) के एक मुरीन मॉडल में सि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एंड्रयू लिम, पीएचडी और Giles सर्वश्रेष्ठ, पीएचडी प्रवाह साइटोमीटर की स्थापना में उनकी मदद के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस परियोजना को पीएच को दिए गए ड्यूश फोर्स्चुंग्सजेमींसचैफ्ट (डीएफजी) (डीएफजी-एचए 8481/1-1) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| APC anti-mouse CD194 (CCR4) | BioLegend | 131212 | T-Cell Panel | |
| Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst | BD | 566385 | Buffers | |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | T-Cell Panel | |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | Monocyte Panel | |
| Liberase, Research Grade | Roche | 5401127001 | Enzyme for synovial tissue | |
| Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg | BD | 564985 | Monocyte Panel | |
| Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg | BD | 562454 | Monocyte Panel | |
| Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg | BD | 742274 | T-Cell Panel | |
| Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg | BD | 565250 | Monocyte Panel | |
| Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg | BD | 563061 | T-Cell Panel | |
| Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg | BD | 557596 | T-Cell Panel | |
| Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg | BD | 552775 | T-Cell Panel | |
| Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg | BD | 565480 | T-Cell Panel | |
| Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg | BD | 565261 | T-Cell Panel | |
| Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg | BD | 740664 | T-Cell Panel | |
| Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg | BD | 563687 | Monocyte Panel | |
| Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg | BD | 563332 | T-Cell Panel | |
| Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg | BD | 565411 | Monocyte Panel | |
| Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg | BD | 560408 | T-Cell Panel | |
| Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg | BD | 563414 | Monocyte Panel | |
| Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg | BD | 560593 | Monocyte Panel | |
| Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg | BD | 560600 | Monocyte Panel | |
| Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg | BD | 564143 | T-Cell Panel | |
| Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg | BD | 562894 | T-Cell Panel | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | N/A | N/A | Buffers | Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): . |
| Transcription Factor Buffer Set 100Tst | BD | 562574 | Buffers |
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