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의학

골관절염 모델에서 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 치압 조직 내의 면역 세포 하위 집합의 흐름 세포 분석

Published: April 24, 2020
doi:
10.3791/61008
, , , , ,
1Raymond Purves Bone and Joint Research Laboratory, Institute of Bone and Joint Research, Kolling Institute, Royal North Shore Hospital,University of Sydney, 2HTRG – Heidelberg Trauma Research Group, Center for Orthopedics, Trauma Surgery and Spinal Cord Injury, Trauma and Reconstructive Surgery,Heidelberg University Hospital, 3Department of Large Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine,Michigan State University

Summary

여기에서, 우리는 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 교압 조직 내의 엑스트라 세포 염색 분석체를 모두 사용하여 단세포/대식세포 및 T 세포 하위 세트를 식별하기 위해 상세하고 재현 가능한 유동 세포 측정 프로토콜을 설명하며, 골관절염의 확립된 수술 모델을 활용합니다.

Abstract

골관절염 (OA)은 통증과 신체적 한계로 고통받는 환자에게 영향을 미치는 가장 널리 퍼진 근골격계 질환 중 하나입니다. 최근 증거는 잠재적으로 OA의 병기와 관련된 T 세포와 단낭세포 / 대식세포와 함께 질병의 잠재적 인 염증 성분을 나타냅니다. 추가 연구는 Th1, Th2, Th17 및 T 조절 림프구, M1, M2 및 synovium 조직-상주 대식세포와 같은 염증성 세포 계보의 하위 집합에 중요한 역할을 가정했습니다. 그러나, 국부적 및 전신 염증성 세포 반응과 관절의 구조적 변화 사이의 상호 작용은 알려지지 않았다. T 세포와 단핵구/대식세포가 OA쪽으로 어떻게 기여하는지 완전히 이해하려면, 이러한 세포와 그들의 하위 세트를 동시 적으로 규명할 수 있어야 하며, 이차 림프관 및 체계적으로(비장 및 골수). 요즘, 상이한 염증세포 서브세트는 다색 유동 세포측정법을 이러한 세포 과정을 조사하는 강력한 기술을 만드는 세포 표면 마커의 조합에 의해 규명될 수 있다. 이 프로토콜에서, 우리는 단일 세포 현탁액의 생성뿐만 아니라, 교반 조직 및 이차 림프기관의 수확에 관한 상세한 단계를 설명합니다. 더욱이, 우리는 단핵구/대식세포 및 그들의 서브세트를 확인하기 위하여 세포외 염색 분석둘 다 및 murine 비장, 골수, 림프절 및 교유 조직 내의 T 세포 및 그들의 하위 세트를 확인하기 위하여 추가 세포 내 염색 분석. 이 프로토콜의 각 단계는 최적화되고 시험되어 다른 외과 및 비 수술 OA 마우스 모델에 사용할 수있는 매우 재현 가능한 분석이 발생했습니다.

Introduction

골관절염(OA)은 관절1과관련된 모든 조직의 다양한 병리를 포함하는 쇠약하고 고통스러운 질환이다. 전 세계인구의약 3.8%에 영향을 미치는 OA는 가장 널리 퍼진 근골격계 질환 중 하나이며 2020년까지 전 세계적으로4번째로 주요 장애 원인이 될것입니다 3. 외상 후 OA는 관절 부상 후 발생하며 모든 OA의 12 % 이상및 무릎4,,5와같은 취약한 관절에서 OA의 최대 25 %를 차지합니다. 더욱이, 관절 상해는 OA의 일생 리스크를 5배 이상6배이상 증가시킵니다. 분명히 유사한 불안정을 가진 모든 부상은 OA를 개발하기 위해 계속됩니다, 따라서 장기 OA 위험을 구동 요인을 정의하는 것은 도전 남아있다. OA1에걸리기 쉬운 부상 별 병리학, 원인 및 메커니즘을 조사하고 더 잘 정의하기 위해 외상 후 OA를 예방 및 / 또는 치료하는 효과적인 치료법을 개발하기 위해 중요합니다.

OA와 그 정의 연골 파괴는 이전에 기계적 스트레스에 전적으로 기인하고, 따라서, OA는 비 염증성 질환 으로 간주되었다2. 그러나, 최근 연구에 따르면 OA 환자의 혈연 조직 내 의 염증성 침투및 염증성 세포의 증가는 건강한 대조군2에비해, OA의 잠재적 원동력으로서 염증 성분에 빛을 흘리는 것으로 나타났다. 추가 연구는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 프로파일뿐만 아니라 타고난 면역 계통의 단핵구/대식세포 모두에서 이상이 OA2,,7의발병에 기여할 수 있음을 나타냈다. 이러한 이상에 대한 상세한 조사는 Th18,Th29,Th178 및 T 규제(Treg) 인구10,11과같은 다양한 T 세포 서브셋2에대한 관련 역할을 밝혀냈습니다., 이 강력한 증거에도 불구하고, T 세포 반응의 변경과 OA의 개발 및 진행 사이의 인과 관계는 여전히 알 수없는2.

OA에서 역할을 갖는 특정 T 세포 이외에, 최근 연구는 분화 / 활성화 된 대식세포가 OA12의병기와 관련 될 수 있음을 시사한다. 특히, 혈액 단세포에서 유래한 대식세포는 혈중 에서 축적되어 OA 개발 중에 고전적으로 활성화된 대식세포(M1) 또는 대안적으로 활성화된 대식세포(M2)로 편광하여 단세포 유래 대식세포와 OA13사이의 상관관계를 암시한다. 대조적으로, 대식세포의 특정 하위 집합은 개발 도중 일찌기 기관을 채우고 단색 세포 독립적인 물질14에서그들의 수를 자립합니다. 최근에는 이러한 연동 조직-상주 대식세포(STRM)14에대해 단단한 접합 장벽에 의해 중재된 관절 보호 기능이 나타났다. 이 사실 인정은 특히 대식세포 서브셋에 있는 이상이 OA의 발달 도중 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 표시합니다. 그러나, 이 선동적인 세포 반응 및 외상 의 후속 합동에 있는 구조적인 변화 사이 상호 작용은 불명합니다.

역사적으로, 용액 조직에서 면역 세포의 분석은 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의한 면역조직화학(IHC) 또는 mRNA 발현에 제한되었다15,,16. 그러나, IHC와 RT-PCR 둘 다 다중 다른 세포 모형 및 그들의 서브세트를 동시에 식별하는 기능이 부족하여, 따라서, 이 방법의 적용성을 제한합니다. 더욱이, IHC는 조직의 작은 견본의 분석에 국한되고 초점 선동적인 세포 축적을 놓칠 수 있습니다. 지난 몇 년 동안, 다양한 세포 유형에 대한 표면 마커의 무수한 개발되었습니다, 면역 세포의 하위 세트는 이제 안정적으로 이러한 마커의 고유 조합에 의해 식별 될 수있다. 꾸준한 기술적 진보로 인해, 흐름 세포계는 이제 동시에 대형 다중 색 항체 패널의 분석을 가능하게 하는 다양한 다른 형광을 식별할 수 있게 되었다.

유동 세포측정은 조사자에게 단일 세포 수준에서 수많은 면역 세포와 그들의 하위 집합을 동시 식별 및 정량화할 수 있는 강력한 기술을 제공합니다. 우리는 단핵구/대식세포 및 그들의 하위 세트를 확인하기 위하여 세포외 염색 분석물 및 murine 비장, 골수, 림프절 및 교유 조직 내의 T 세포 및 그들의 부세트를 확인하기 위하여 추가/세포 내 염색 분석 둘 다를 개발하고 최적화했습니다. 이 프로토콜의 각 단계는 최적화및 다른 외과 적 OA 마우스 모델(17)에사용할 수있는 매우 재현 가능한 분석의 결과로 테스트되었다.

Protocol

노던 시드니 지역 보건 지구 동물 윤리위원회는이 프로토콜에 언급 된 모든 절차를 승인했습니다. 마우스는 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 가이드에 따라 보관 및 관리 (호주의 국립 건강 및 의학 연구 위원회 개정 2010). 모든 실험에 대해 10-12주 된 남성 C57BL/6 마우스가 활용되었다. 참고: 외상 후 OA를 유도하기 위해, 오른쪽 위관절에서 내측 반월상 연골(DMM)?…

Representative Results

모노사이클 서브셋 패널과 T셀 서브셋 패널의 대표적인 결과는 아래에 설명되어 있다. 도 1은 DMM 처리동물의 골수로부터 수집된 면역 세포상핵세포 에 대한 단핵제 서브셋 패널을 위한 계층적 게이팅 전략을 도시한다. 동일한 전략이 사용되었고 다른 모든 조직 유형에서 확인되었습니다. 실험을 설정할 때, 전방 분산 영역(FSC-A) 및 측면 분산 영역(SSC-A) ?…

Discussion

이 프로토콜에 기술된 방법은 골관절염(OA)의 뮤린 모델에서 모낭/대식세포 및 T세포 모두에서 다양한 하위 집합을 안정적으로 식별하도록 설계 및 테스트되었습니다. 현재 프로토콜은 항체를 교환하여 상이한 조직 모형, 또는 그밖 세포 모형을 조사하기 위하여 쉽게 변형될 수 있고, OA의 대체 뮤린 모형을 위해 이용될 수 있다. 다른 조직 유형을 테스트할 때, 면역 세포의 표면 마커의 발현이 각<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 앤드류 림, 박사 와 자일스 베스트, 유동 세포계를 설정하는 데 도움을 주셔서 감사드립니다. 이 프로젝트는 PH에 수여 도이치 포충스게마인샤프트 (DFG) (DFG-HA 8481/1-1)에 의해 지원되었다.

Materials

APC anti-mouse CD194 (CCR4) BioLegend 131212 T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst BD 566385 Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µg BD 564406 T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µg BD 564406 Monocyte Panel
Liberase, Research Grade Roche 5401127001 Enzyme for synovial tissue
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg BD 564985 Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg BD 562454 Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg BD 742274 T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg BD 565250 Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg BD 563061 T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg BD 557596 T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg BD 552775 T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg BD 565480 T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg BD 565261 T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg BD 740664 T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg BD 563687 Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg BD 563332 T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg BD 565411 Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg BD 560408 T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg BD 563414 Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg BD 560593 Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg BD 560600 Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg BD 564143 T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg BD 562894 T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing Buffer N/A N/A Buffers Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .
Transcription Factor Buffer Set 100Tst BD 562574 Buffers
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References

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Haubruck, P., Colbath, A. C., Liu, Y., Stoner, S., Shu, C., Little, C. B. Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model. J. Vis. Exp. (158), e61008, doi:10.3791/61008 (2020).
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