골관절염 모델에서 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 치압 조직 내의 면역 세포 하위 집합의 흐름 세포 분석

요약

여기에서, 우리는 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 교압 조직 내의 엑스트라 세포 염색 분석체를 모두 사용하여 단세포/대식세포 및 T 세포 하위 세트를 식별하기 위해 상세하고 재현 가능한 유동 세포 측정 프로토콜을 설명하며, 골관절염의 확립된 수술 모델을 활용합니다.

초록

골관절염 (OA)은 통증과 신체적 한계로 고통받는 환자에게 영향을 미치는 가장 널리 퍼진 근골격계 질환 중 하나입니다. 최근 증거는 잠재적으로 OA의 병기와 관련된 T 세포와 단낭세포 / 대식세포와 함께 질병의 잠재적 인 염증 성분을 나타냅니다. 추가 연구는 Th1, Th2, Th17 및 T 조절 림프구, M1, M2 및 synovium 조직-상주 대식세포와 같은 염증성 세포 계보의 하위 집합에 중요한 역할을 가정했습니다. 그러나, 국부적 및 전신 염증성 세포 반응과 관절의 구조적 변화 사이의 상호 작용은 알려지지 않았다. T 세포와 단핵구/대식세포가 OA쪽으로 어떻게 기여하는지 완전히 이해하려면, 이러한 세포와 그들의 하위 세트를 동시 적으로 규명할 수 있어야 하며, 이차 림프관 및 체계적으로(비장 및 골수). 요즘, 상이한 염증세포 서브세트는 다색 유동 세포측정법을 이러한 세포 과정을 조사하는 강력한 기술을 만드는 세포 표면 마커의 조합에 의해 규명될 수 있다. 이 프로토콜에서, 우리는 단일 세포 현탁액의 생성뿐만 아니라, 교반 조직 및 이차 림프기관의 수확에 관한 상세한 단계를 설명합니다. 더욱이, 우리는 단핵구/대식세포 및 그들의 서브세트를 확인하기 위하여 세포외 염색 분석둘 다 및 murine 비장, 골수, 림프절 및 교유 조직 내의 T 세포 및 그들의 하위 세트를 확인하기 위하여 추가 세포 내 염색 분석. 이 프로토콜의 각 단계는 최적화되고 시험되어 다른 외과 및 비 수술 OA 마우스 모델에 사용할 수있는 매우 재현 가능한 분석이 발생했습니다.

서론

골관절염(OA)은 관절^1과관련된 모든 조직의 다양한 병리를 포함하는 쇠약하고 고통스러운 질환이다. 전 세계^인구의약 3.8%에 영향을 미치는 OA는 가장 널리 퍼진 근골격계 질환 중 하나이며 2020년까지 전 세계적으로^4번째로 주요 장애 원인이 될^{것입니다 3.} 외상 후 OA는 관절 부상 후 발생하며 모든 OA의 12 % 이상및 무릎^4,,5와같은 취약한 관절에서 OA의 최대 25 %를 차지합니다. 더욱이, 관절 상해는 OA의 일생 리스크를 5배 이상^6배이상 증가시킵니다. 분명히 유사한 불안정을 가진 모든 부상은 OA를 개발하기 위해 계속됩니다, 따라서 장기 OA 위험을 구동 요인을 정의하는 것은 도전 남아있다. OA^1에걸리기 쉬운 부상 별 병리학, 원인 및 메커니즘을 조사하고 더 잘 정의하기 위해 외상 후 OA를 예방 및 / 또는 치료하는 효과적인 치료법을 개발하기 위해 중요합니다.

OA와 그 정의 연골 파괴는 ....

프로토콜

노던 시드니 지역 보건 지구 동물 윤리위원회는이 프로토콜에 언급 된 모든 절차를 승인했습니다. 마우스는 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 가이드에 따라 보관 및 관리 (호주의 국립 건강 및 의학 연구 위원회 개정 2010). 모든 실험에 대해 10-12주 된 남성 C57BL/6 마우스가 활용되었다.

참고: 외상 후 OA를 유도하기 위해, 오른쪽 위관절에서 내측 반월상 연골(DMM)의 외과적 불안정이 수행되었다. 이 동물 모델에 대한 자세한 정보는 Glasson 외^18에의해 출판되었다. 요컨대, 전신 마취는 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 유도되고 그 후 코 콘을 사용하여 유지된다. 수술용 다리는 면도칼로 면도하고 수술 부위는 오염을 최소화하기 위해 에탄올로 세척및 스왑됩니다. 동물은 수술 현미경으로 이동하고 멸균 수건에 배치하고 수술 부위를 격리하고 오염을 최소화하기 위해 멸균 종이 드레이프로 드레이프 다리. 현미경을 사용하여 0.5cm 내측 파라 슬개골 관절 절제술이 만들어지고, 슬개골은 측면으로 호화되고, 적외선 슬개골 지방 패드는 내측 반미코-티비알 인대를 노출시키기 위해 상승하여 해부된 집게로 방사됩니다. 관절은 어떤 혈액을 제거하기 위해 멸균 식염수로 플러....

결과

모노사이클 서브셋 패널과 T셀 서브셋 패널의 대표적인 결과는 아래에 설명되어 있다.

도 1은 DMM 처리동물의 골수로부터 수집된 면역 세포상핵세포 에 대한 단핵제 서브셋 패널을 위한 계층적 게이팅 전략을 도시한다. 동일한 전략이 사용되었고 다른 모든 조직 유형에서 확인되었습니다. 실험을 설정할 때, 전방 분산 영역(FSC-A) 및 측면 분산 영역(SSC-A) 전압은 각 조직 유형에 대해 단핵구/대식세포를 식별하고 T 세포 및 이물질을 제외하도록 결정하였다. 각 실험 동안 각 조직 유형의 미염색 된 컨트롤을 분석하고 필요한 경우 FSC-A 및 SSC-A 전압을 조정했습니다. 매개 변수가 사이토미터의 막힘가능성이 크게 변경되면 전압은 시간이 지남에 따라 유사하게 유지될 것으로 예상됩니다. 더욱이, 미염색된 컨트롤은 실험이 그에 따라 수행될 때마다 죽은/살아있는 얼룩 및 게이트에 대한 진정한 네거티브를 결정하는 데

토론

이 프로토콜에 기술된 방법은 골관절염(OA)의 뮤린 모델에서 모낭/대식세포 및 T세포 모두에서 다양한 하위 집합을 안정적으로 식별하도록 설계 및 테스트되었습니다. 현재 프로토콜은 항체를 교환하여 상이한 조직 모형, 또는 그밖 세포 모형을 조사하기 위하여 쉽게 변형될 수 있고, OA의 대체 뮤린 모형을 위해 이용될 수 있다. 다른 조직 유형을 테스트할 때, 면역 세포의 표면 마커의 발현이 각^{조직(20)에서}변화함에 따라 각 항체의 특이성을 테스트하는 것이 중요하다. 또한, 항체를 교환할 때, 항체의 최적 농도를 확립하고 스펙트럼 중첩의 변화를 해결하기 위해 보상 과정을 반복하기 위해 투여량 적정 곡선을 수행해야 한다.

현재 프로토콜에서, OA는 DMM 마우스^{모델(18)을}사용하여 유도되었다. 가장 일반적으로 사용 되고 확립 된 동물 모델은 마우스에, 이 종은 외상 후 OA의 병리 생리학을 조사에 다가.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
APC 안티 마우스 CD194 (CCR4)	BioLegend	131212	T 세포 패널
브릴리언트 염색 버퍼 플러스 1000Tst	BD	566385	버퍼
고정 생존도 염색 510, 100 µ g	BD	564406	T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µ g	BD	564406	Monocyte Panel
Liberase, 활	막 조직 용	Roche	5401127001
Ms CD11b APC-R700 M1 / 70, 100 µ g	BD	564985	단핵구 패널
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µ g	BD	562454	단핵구 패널
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µ g	BD	742274	T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µ g	BD	565250	단핵구 패널
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µ g	BD	563061	T-셀 패널
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 &마이크로; g	BD	557596	T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µ g	BD	552775	T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µ g	BD	565480	T-셀 패널
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µ g	BD	565261	T-셀 패널
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 &마이크로; g	BD	740664	T-셀 패널
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 &마이크로; g	BD	563687	단핵구 패널
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µ g	BD	563332	T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µ g	BD	565411	단핵구 패널
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µ g	BD	560408	T 셀 패널
Ms I-A IE-E BV711 M5 / 114.15.2, 50 µ g	BD	563414	단핵구 패널
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µ g	BD	560593	단핵구 패널
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µ g	BD	560600	단핵구 패널
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µ g	BD	564143	T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 &마이크로; g	BD	562894	T 세포 패널
적혈구 용해 버퍼	N/A	N/A	버퍼
전사 인자 버퍼 세트 100Tst	BD	562574	버퍼

연구 학년 효소