Bir Osteoartrit Modelinde Minör Dalak, Kemik İliği, Lenf Düğümleri ve Sinovyal DokuDaki İmmün Hücre Alt Kümelerinin Akış Sitometri Analizi
Summary
Burada, murine dalak, kemik iliği, lenf düğümleri ve sinovyal doku içinde hem ekstra hem de hücre içi boyama tahlilleri kullanarak monosit/makrofaj ve T hücrealt kümelerini tanımlamak için ayrıntılı ve tekrarlanabilir akış sitometri protokolünü tanımladık ve murine osteoartritin yerleşik bir cerrahi modelini kullanıyoruz.
Abstract
Osteoartrit (OA) en yaygın kas-iskelet sistemi hastalıklarından biridir, ağrı ve fiziksel sınırlamalar muzdarip hastaları etkileyen. Son kanıtlar, hem T-hücreleri hem de monositler/makrofajlar potansiyel olarak OA patogenezi ile ilişkili olan hastalığın potansiyel inflamatuar bileşenini göstermektedir. Daha ileri çalışmalar, Th1, Th2, Th17 ve T-düzenleyici lenfositler ve M1, M2 ve sinovyum-doku-yerleşik makrofajlar gibi her iki inflamatuar hücre soyundan alt kümeleri için önemli bir rol öne çıkar. Ancak lokal sinovyal ve sistemik inflamatuar hücresel yanıt ile eklemdeki yapısal değişiklikler arasındaki etkileşim bilinmemektedir. T-hücrelerinin ve monositlerin/makrofajların OA’ya nasıl katkıda bulunduklarını tam olarak anlamak için, bu hücreleri ve alt kümelerini aynı anda sinovyal dokuda, sekonder lenfatik organlarda ve sistemli (dalak ve kemik iliği) sayısal olarak tanımlayabilmek önemlidir. Günümüzde, farklı inflamatuar hücre alt kümeleri hücre-yüzey belirteçleri çok renkli akış sitometri bu hücresel süreçleri araştıran güçlü bir teknik yapma bir kombinasyonu ile tespit edilebilir. Bu protokolde, sinovyal doku ve sekonder lenfatik organların hasadı ve tek hücreli süspansiyonların üretimi ile ilgili ayrıntılı adımları açıklıyoruz. Ayrıca, monositleri/makrofajları ve alt kümelerini tanımlamak için hem hücre dışı bir boyama testi hem de t-hücrelerini ve bunların alt kümelerini belirlemek için ürinen dalak, kemik iliği, lenf düğümleri ve sinovyal dokuları sinovyal dokuları sifon larını satıyoruz. Bu protokolün her adımı optimize edildi ve test edildi, diğer cerrahi ve cerrahi olmayan OA fare modelleri için kullanılabilen son derece tekrarlanabilir bir test ile sonuçlandı.
Introduction
Osteoartrit (OA) eklem ile ilişkili tüm dokuların çeşitli patolojiler içeren zayıflatıcı ve ağrılı bir hastalıktır1. Küresel nüfusun yaklaşık% 3.8 etkileyen2,OA en yaygın kas-iskelet hastalıkları biridir ve 20203tarafından dünya çapında 4önde gelen sakatlık nedeni olmaktır. Post-travmatik OA eklem yaralanması ndan sonra ortaya çıkar ve tüm OA en az% 12 ve diz gibi duyarlı eklemlerde OA kadar% 25 için hesaplar4,5. Ayrıca, eklem yaralanması fazla beş kat6OA yaşam boyu riskini artırır. Görünüşte benzer istikrarsızlık ile tüm yaralanmalar OA geliştirmek için devam edecek, ve bu nedenle uzun vadeli OA-risk sürücü faktörler tanımlayan zorlu kalır. Travma sonrası OA’yı önlemek ve/veya tedavi etmek, yaralanmaya özgü patolojiyi, nedenleri ve OA1’eyatkın mekanizmaları araştırmak ve daha iyi tanımlamak için etkili tedaviler geliştirmek çok önemlidir.
OA ve tanımlayıcı kıkırdak yıkımı daha önce tamamen mekanik strese atfedildi ve bu nedenle, OA non-inflamatuar bir hastalık olarak kabul edildi2. Ancak, daha yeni çalışmalar sinovyal membranların inflamatuar infiltrasyon ve Sağlıklı kontroller ile karşılaştırıldığında OA olan hastalarda sinovyal dokuda inflamatuar hücrelerin bir artış göstermiştir2, OA potansiyel bir itici güç olarak inflamatuar bir bileşene ışık talan. Daha ileri çalışmalar cd4 + ve CD8 + T-hücre profili yanı sıra doğuştan gelen bağışıklık sisteminin monosit / makrofajlar anormallikleri OA 2 patogenezine katkıda bulunabileceğini göstermiştir.,7 Bu anormallikler içine ayrıntılı araştırmalar çeşitli T hücre alt kümeleri için ilgili roller ortaya2, Th18gibi 8 , Th29, Th178 ve T düzenleyici (Treg) popülasyonları10,11. Bu ikna edici kanıtlara rağmen, T-hücre yanıtlarının değiştirilmesi ile OA’nın gelişimi ve ilerlemesi arasındaki nedensel ilişki hala bilinmemektedir2.
OA’da rol alan spesifik T hücrelerine ek olarak, son çalışmalar farklıpolarize/aktive makrofajların OA12patogenezi ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Özellikle kan monositlerinden kaynaklanan makrofajlar sinovyumda birikir ve oa gelişimi sırasında klasik olarak aktive edilmiş makrofajlara (M1) veya alternatif olarak aktive makrofajlara (M2) polarize olur, bu da monosit türevi makrofajlar ile OA13arasında bir korelasyon olduğunu ima eder. Buna karşılık, makrofajlar bazı alt kümeleri gelişme sırasında erken organları doldurmak ve teksit bağımsız madde14kendi sayılarını sürdürmek. Son zamanlarda, bu sinovyal doku yerleşik makrofajlar (STRMs)14için dar bir kavşak bariyer aracılık eklem koruyucu fonksiyon gösterilmiştir. Bu bulgular, özellikle makrofaj alt kümelerinde anormalliklerin OA gelişimi sırasında önemli bir rol oynayabilir göstermektedir. Ancak, bu inflamatuar hücresel yanıt ve travma sonrasında eklem yapısal değişiklikler arasındaki etkileşimleri bilinmemektedir.
Tarihsel olarak, sinovyal dokuda bağışıklık hücrelerinin analizi ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yaklaşımlar tarafından immünohistokimya (IHC) veya mRNA ekspresyonu ile sınırlı ydı15,16. Ancak, hem IHC hem de RT-PCR aynı anda birden fazla farklı hücre türünü ve alt kümelerini belirleyebilme yeteneğine sahip değildir, böylece bu yöntemlerin uygulanabilirliğini sınırlandırmaktadır. Ayrıca, IHC doku küçük örneklerin analizi ile sınırlıdır ve fokal inflamatuar hücre birikimleri kaçırabilir. Son birkaç yıl içinde, çeşitli hücre tipleri için yüzey belirteçleri sayısız geliştirilmiştir, ve bağışıklık hücrelerinin alt kümeleri artık güvenilir bu belirteçlerin farklı kombinasyonları ile tespit edilebilir. Sürekli teknik ilerleme nedeniyle, akış sitometreler artık aynı anda büyük çok renkli antikor panelleri analizi sağlayan farklı florokromlar çok sayıda tespit yeteneğine sahiptir.
Akış sitometrisi, araştırmacılara, çok sayıda bağışıklık hücresinin ve alt kümelerinin tek hücre düzeyinde eşzamanlı olarak tanımlanmasını ve ölçülmesine olanak tanıyan güçlü bir teknik sağlar. Monositleri/makrofajları ve alt kümelerini tanımlamak için hem hücre dışı bir boyama testi geliştirdik hem de t-hücrelerini ve bunların alt kümelerini murin dalak, kemik iliği, lenf düğümleri ve sinovyal doku içinde tanımlamak için ekstra/hücre içi boyama testi geliştirdik ve optimize ettik. Bu protokolün her adımı optimize edilmiş ve diğer cerrahi ve cerrahi olmayan OA fare modelleri için kullanılabilir son derece tekrarlanabilir bir test17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde tanımlanan yöntemler, minrik dalak, kemik iliği, lenf düğümleri ve sinovyal doku daki monosit/makrofajve T-hücrelerinden çeşitli alt kümeleri güvenilir bir şekilde tanımlamak için tasarlanmış ve test edilmiştir . Mevcut protokol kolayca farklı doku tipleri araştırmak için değiştirilebilir, veya diğer hücre tipleri antikoralışverişi tarafından, ve OA alternatif murine modelleri için kullanılabilir. Diğer doku tipleri test edilirken, bağışıklık hücrelerinin yüzey belirte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Andrew Lim, Ph.D. ve Giles Best, Ph.D. akış sitometre kurma yardımları için teşekkür etmek istiyorum. Bu proje, PH’ye verilen Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG- HA 8481/1-1) tarafından desteklendi.
Materials
| APC anti-mouse CD194 (CCR4) | BioLegend | 131212 | T-Cell Panel | |
| Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst | BD | 566385 | Buffers | |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | T-Cell Panel | |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | Monocyte Panel | |
| Liberase, Research Grade | Roche | 5401127001 | Enzyme for synovial tissue | |
| Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg | BD | 564985 | Monocyte Panel | |
| Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg | BD | 562454 | Monocyte Panel | |
| Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg | BD | 742274 | T-Cell Panel | |
| Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg | BD | 565250 | Monocyte Panel | |
| Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg | BD | 563061 | T-Cell Panel | |
| Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg | BD | 557596 | T-Cell Panel | |
| Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg | BD | 552775 | T-Cell Panel | |
| Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg | BD | 565480 | T-Cell Panel | |
| Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg | BD | 565261 | T-Cell Panel | |
| Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg | BD | 740664 | T-Cell Panel | |
| Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg | BD | 563687 | Monocyte Panel | |
| Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg | BD | 563332 | T-Cell Panel | |
| Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg | BD | 565411 | Monocyte Panel | |
| Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg | BD | 560408 | T-Cell Panel | |
| Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg | BD | 563414 | Monocyte Panel | |
| Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg | BD | 560593 | Monocyte Panel | |
| Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg | BD | 560600 | Monocyte Panel | |
| Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg | BD | 564143 | T-Cell Panel | |
| Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg | BD | 562894 | T-Cell Panel | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | N/A | N/A | Buffers | Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): . |
| Transcription Factor Buffer Set 100Tst | BD | 562574 | Buffers |
References
- Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).
- Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond. Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).
- Woolf, A. D., Pfleger, B. Burden of major musculoskeletal conditions. Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).
- Little, C. B., Hunter, D. J. Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials. Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).
- Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention. Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).
- Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).
- Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis. Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).
- Yamada, H., et al. Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints. Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).
- Sakkas, L. I., et al. T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis. Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).
- Guo, S. Y., et al. Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis. Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).
- Moradi, B., et al. CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints–analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood. Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97 (2014).
- Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees. Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).
- Zhang, H., et al. Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).
- Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572, 670-675 (2019).
- Mocellin, S., et al. Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment. Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).
- Ward, J. M., et al. Immunohistochemical markers for the rodent immune system. Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).
- Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Lorenz, J., Grassel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).
- Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
- Shi, J., et al. Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice. Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
- Zhao, J., et al. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).
- Belluzzi, E., et al. Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain. BioMed Research International. 2019, 18 (2019).
