Undersøkelse av Xenobiotics Metabolism i Salix alba blader via massespektrometri imaging

Summary

Denne metoden bruker massespektrometriavbildning (MSI) for å forstå metabolske prosesser i S. alba blader når de utsettes for xenobiotika. Metoden tillater romlig lokalisering av forbindelser av interesse og deres predikerte metabolitter innenfor spesifikke, intakte vev.

Abstract

Metoden som presenteres bruker massespektrometriavbildning (MSI) for å etablere den metabolske profilen til S. alba blader når den utsettes for xenobiotika. Ved hjelp av en ikke-målrettet tilnærming identifiseres og lokaliseres plantemetabolitter og xenobiotika av interesse i plantevev for å avdekke spesifikke distribusjonsmønstre. Deretter, i silico prediksjon av potensielle metabolitter (dvs. katabolitter og konjugater) fra identifiserte xenobiotika utføres. Når en xenobiotisk metabolitt ligger i vevet, registreres typen enzym som er involvert i plantens endring. Disse resultatene ble brukt til å beskrive ulike typer biologiske reaksjoner som forekommer i S. alba blader som svar på xenobiotisk akkumulering i bladene. Metabolittene ble spådd i to generasjoner, slik at dokumentasjonen av påfølgende biologiske reaksjoner kunne transformere xenobiotika i bladvevet.

Introduction

Xenobiotics er utbredt over hele verden på grunn av menneskelige aktiviteter. Noen av disse forbindelsene er vannløselige og absorberes av jord¹, og går inn i næringskjeden når de akkumuleres i plantevev^2,3,4. Plantene spises av insekter og plantelevende dyr, som er byttedyr til andre organismer. Inntaket av noen xenobiotika og deres innvirkning på plantens helse har blitt beskrevet^5,6,7,8, men bare nylig på vevsnivå⁹. Derfor er det fortsatt uklart hvor eller hvordan metabolismen av xenobiotika oppstår, eller om spesifikke plantemetabolitter er korrelert med xenobiotisk akkumulering i bestemte vev¹⁰. Videre har de fleste undersøkelser oversett metabolismen av xenobiotika og deres metabolitter i planter, så lite er kjent om disse reaksjonene i plantevev.

Foreslått her er en metode for å undersøke enzymatiske reaksjoner i biologiske prøver som kan knyttes til vev lokalisering av substrater og produkter av reaksjonene. Metoden kan tegne den komplette metabolske profilen til en biologisk prøve i ett eksperiment, da analysen er ikke-målrettet og kan undersøkes ved hjelp av tilpassede lister over analytter av interesse. Angitt er en liste over kandidater som spores i det opprinnelige datasettet. Hvis en eller flere analytter av interesse er notert i prøven, kan den spesifikke vevslokaliseringen gi viktig informasjon om de relaterte biologiske prosessene. Analyttene av interesse kan deretter endres i silico ved hjelp av relevante biologiske lover for å søke etter mulige produkter / metabolitter. Listen over metabolitter oppnådd brukes deretter til å analysere de opprinnelige dataene ved å identifisere enzymene som er involvert og lokalisere reaksjonene i vevet, og dermed bidra til å forstå de forekommende metabolske prosessene. Ingen annen metode gir informasjon om hvilke typer reaksjoner som forekommer i de biologiske prøvene, lokalisering av forbindelsene av interesse og deres relaterte metabolitter. Denne metoden kan brukes på alle typer biologisk materiale når friske og intakte vev er tilgjengelige og forbindelsene av interesse kan ioniseres. Den foreslåtte protokollen ble publisert i Villette et al.¹² og er detaljert her for bruk av det vitenskapelige samfunnet.

Protocol

1. Prøvepreparering Ta tak i den biologiske prøven og hold den frisk og intakt (f.eks. ikke tving den inn i et rør) eller frys den. Den foreslåtte protokollen gjelder for alle typer faste biologiske prøver (dvs. plante,dyr eller humant vev) for å lokalisere forbindelser i spesifikt vev. Avkjøl en kryokrotom til -20 °C. Oppbevar prøveholderen og bladet ved samme temperatur. Bygg om nødvendig inn objektet i M1-innebyggingsmediet for å bevare det under kutting. Hell litt mat…

Representative Results

Denne protokollen ble brukt på friske blader samplet fra et S. alba-tre utsatt for xenobiotika i miljøet. Prosessen er avbildet i figur 1. Det første trinnet er å forberede tynne skiver av utvalget av interesse. Planteprøver er ofte vanskeligere å kutte enn dyreprøver, da vevet er heterogent og kan inneholde vann og / eller luft. Denne vanskeligheten håndteres ved hjelp av innebyggingsmedium, som danner en homogen blokk rundt prøven. Matriseavsetningen forenkles ved bruk av…

Discussion

Den kritiske delen av denne protokollen er prøveforberedelsene: prøven må være myk og intakt. Kutting er den vanskeligste delen, da temperaturen og tykkelsen på prøven kan variere avhengig av hvilken type prøve som studeres. Dyrevev er vanligvis homogene og lettere å kutte. Planteprøver inneholder ofte forskjellige strukturer og er derfor vanskeligere å holde intakt når bladet møter mykt, hardt eller tomt vaskulært vev. Det anbefales på det sterkeste å bruke friskt vev når du arbeider med planteprøver fo…

Materials

Cover slips	Bruker Daltonics	267942
Cryomicrotome	Thermo Scientific
Excel	Microsoft corporation
flexImaging	Bruker Daltonics
ftmsControl	Bruker Daltonics
GTX primescan	GX Microscopes
HCCA MALDI matrix	Bruker Daltonics	8201344
ImagePrep	Bruker Daltonics
ITO-coated slides	Bruker Daltonics	237001
M1-embedding matrix	ThermoScientific	1310
Metabolite Predict	Bruker Daltonics
Metaboscape	Bruker Daltonics
Methanol	Fisher Chemicals		No specific reference needed
MX 35 Ultra blades	Thermo Scientific	15835682
Plastic molds			No specific reference needed
SCiLS Lab	Bruker Daltonics
SolariX XR 7Tesla	Bruker Daltonics		The method proposed is not limited to this instrument
Spray sheets for ImagePrep	Bruker Daltonics	8261614
TFA	Sigma Aldrich		No specific reference needed