Denne metoden bruker massespektrometriavbildning (MSI) for å forstå metabolske prosesser i S. alba blader når de utsettes for xenobiotika. Metoden tillater romlig lokalisering av forbindelser av interesse og deres predikerte metabolitter innenfor spesifikke, intakte vev.
Metoden som presenteres bruker massespektrometriavbildning (MSI) for å etablere den metabolske profilen til S. alba blader når den utsettes for xenobiotika. Ved hjelp av en ikke-målrettet tilnærming identifiseres og lokaliseres plantemetabolitter og xenobiotika av interesse i plantevev for å avdekke spesifikke distribusjonsmønstre. Deretter, i silico prediksjon av potensielle metabolitter (dvs. katabolitter og konjugater) fra identifiserte xenobiotika utføres. Når en xenobiotisk metabolitt ligger i vevet, registreres typen enzym som er involvert i plantens endring. Disse resultatene ble brukt til å beskrive ulike typer biologiske reaksjoner som forekommer i S. alba blader som svar på xenobiotisk akkumulering i bladene. Metabolittene ble spådd i to generasjoner, slik at dokumentasjonen av påfølgende biologiske reaksjoner kunne transformere xenobiotika i bladvevet.
Xenobiotics er utbredt over hele verden på grunn av menneskelige aktiviteter. Noen av disse forbindelsene er vannløselige og absorberes av jord1, og går inn i næringskjeden når de akkumuleres i plantevev2,3,4. Plantene spises av insekter og plantelevende dyr, som er byttedyr til andre organismer. Inntaket av noen xenobiotika og deres innvirkning på plantens helse har blitt beskrevet5,6,7,8, men bare nylig på vevsnivå9. Derfor er det fortsatt uklart hvor eller hvordan metabolismen av xenobiotika oppstår, eller om spesifikke plantemetabolitter er korrelert med xenobiotisk akkumulering i bestemte vev10. Videre har de fleste undersøkelser oversett metabolismen av xenobiotika og deres metabolitter i planter, så lite er kjent om disse reaksjonene i plantevev.
Foreslått her er en metode for å undersøke enzymatiske reaksjoner i biologiske prøver som kan knyttes til vev lokalisering av substrater og produkter av reaksjonene. Metoden kan tegne den komplette metabolske profilen til en biologisk prøve i ett eksperiment, da analysen er ikke-målrettet og kan undersøkes ved hjelp av tilpassede lister over analytter av interesse. Angitt er en liste over kandidater som spores i det opprinnelige datasettet. Hvis en eller flere analytter av interesse er notert i prøven, kan den spesifikke vevslokaliseringen gi viktig informasjon om de relaterte biologiske prosessene. Analyttene av interesse kan deretter endres i silico ved hjelp av relevante biologiske lover for å søke etter mulige produkter / metabolitter. Listen over metabolitter oppnådd brukes deretter til å analysere de opprinnelige dataene ved å identifisere enzymene som er involvert og lokalisere reaksjonene i vevet, og dermed bidra til å forstå de forekommende metabolske prosessene. Ingen annen metode gir informasjon om hvilke typer reaksjoner som forekommer i de biologiske prøvene, lokalisering av forbindelsene av interesse og deres relaterte metabolitter. Denne metoden kan brukes på alle typer biologisk materiale når friske og intakte vev er tilgjengelige og forbindelsene av interesse kan ioniseres. Den foreslåtte protokollen ble publisert i Villette et al.12 og er detaljert her for bruk av det vitenskapelige samfunnet.
Den kritiske delen av denne protokollen er prøveforberedelsene: prøven må være myk og intakt. Kutting er den vanskeligste delen, da temperaturen og tykkelsen på prøven kan variere avhengig av hvilken type prøve som studeres. Dyrevev er vanligvis homogene og lettere å kutte. Planteprøver inneholder ofte forskjellige strukturer og er derfor vanskeligere å holde intakt når bladet møter mykt, hardt eller tomt vaskulært vev. Det anbefales på det sterkeste å bruke friskt vev når du arbeider med planteprøver fo…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Charles Pineau, Mélanie Lagarrigue og Régis Lavigne for deres tips og triks angående prøvepreparering for MALDI-avbildning av planteprøver.
Cover slips | Bruker Daltonics | 267942 | |
Cryomicrotome | Thermo Scientific | ||
Excel | Microsoft corporation | ||
flexImaging | Bruker Daltonics | ||
ftmsControl | Bruker Daltonics | ||
GTX primescan | GX Microscopes | ||
HCCA MALDI matrix | Bruker Daltonics | 8201344 | |
ImagePrep | Bruker Daltonics | ||
ITO-coated slides | Bruker Daltonics | 237001 | |
M1-embedding matrix | ThermoScientific | 1310 | |
Metabolite Predict | Bruker Daltonics | ||
Metaboscape | Bruker Daltonics | ||
Methanol | Fisher Chemicals | No specific reference needed | |
MX 35 Ultra blades | Thermo Scientific | 15835682 | |
Plastic molds | No specific reference needed | ||
SCiLS Lab | Bruker Daltonics | ||
SolariX XR 7Tesla | Bruker Daltonics | The method proposed is not limited to this instrument | |
Spray sheets for ImagePrep | Bruker Daltonics | 8261614 | |
TFA | Sigma Aldrich | No specific reference needed |