الكشف عن البروتين S-Acylation باستخدام Acyl-الراتنج بمساعدة التقاط
Summary
Acyl-RAC (Acyl-Resin المساعدة على التقاط) هو حساس للغاية وموثوق بها وسهلة لأداء طريقة للكشف عن تعديل الدهون عكسها من مخلفات السيستين (S-acylation) في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية.
Abstract
البروتين S-acylation، ويشار إليها أيضا باسم S-palmitoylation، هو تعديل عكسها بعد الترجمة من مخلفات السيستين مع الأحماض الدهنية طويلة السلسلة عن طريق السندات ثيويستر labile. ويمكن لـ S-acylation، الذي يظهر كآلية تنظيمية واسعة النطاق، أن تعدل تقريبا جميع جوانب النشاط البيولوجي للبروتينات، من التكوين المعقد إلى الاتجار بالبروتين واستقرار البروتين. وقد تحقق التقدم المحرز مؤخرا في فهم الوظيفة البيولوجية للبروتين S-acylation إلى حد كبير بسبب تطوير أدوات كيميائية حيوية جديدة تسمح بالكشف القوي والحساس للبروتين S-acylation في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية. هنا، ونحن نصف acyl الراتنج بمساعدة القبض (Acyl-RAC)، وهي طريقة وضعت مؤخرا على أساس التقاط انتقائي من البروتينات S-acylated الذاتي ة من قبل الخرز سيفوريد رد الفعل ثيول. بالمقارنة مع النهج القائمة ، يتطلب Acyl-RAC خطوات أقل ويمكن أن تسفر عن نتائج أكثر موثوقية عندما يقترن بقياس الطيف الكتلي لتحديد أهداف S-acylation الجديدة. أحد القيود الرئيسية في هذه التقنية هو عدم القدرة على التمييز بين أنواع الأحماض الدهنية المرتبطة السيستينعبر نفس رابطة ثيويستر.
Introduction
S-acylation هو تعديل عكسها بعد الترجمة التي تنطوي على إضافة سلسلة أسيل الدهنية إلى بقايا السيستين الداخلية على البروتين المستهدف عن طريق السندات ثيويستر labile1. تم الإبلاغ لأول مرة عن تعديل البروتينات مع البالميتات ، وهو حمض دهني مشبع بـ 16 كربونًا2، وبالتالي غالبًا ما يشار إلى هذا التعديل باسم S-palmitoylation. بالإضافة إلى البالميتات ، يمكن تعديل البروتينات بشكل عكسي من خلال مجموعة متنوعة من التشبع الأطول والأقصر (myristate و stearate) ، غير المشبعة (الأوليات) ومتعددة غير المشبعة (الأراكيدونات والإسيكوسابينتانات) الأحماض الدهنية3،4،5،6،7. في الخلايا eukaryotic، هو تحفيز S-acylzation من قبل عائلة من الإنزيمات المعروفة باسم acyltransferases البروتين DHHC ورد الفعل العكسي من السيستين deacylation هو تحفيز من قبل thioesterases البروتين، ومعظمها لا تزال غامضة8.
قابلية رابطة ثيويستر يجعل هذا التعديل الدهون عكسها، مما يسمح لها لتنظيم حيوي تجمع البروتين، وتوطين غشاء البلازما، والاتجار داخل الخلايا، والتفاعلات البروتين البروتين واستقرار البروتين9،10. وبالتالي، تم ربط S-acylation إلى العديد من الاضطرابات بما في ذلك مرض هنتنغتون، ومرض الزهايمر وعدة أنواع من السرطان (البروستاتا، المعدة، المثانة، الرئة، القولون والمستقيم)، مما يتطلب تطوير طرق موثوق بها للكشف عن هذا التعديل البروتين بعد الترجمة11.
العلامات الأيضية مع المشعة([3H]، [14C] أو[125I]) palmitate كان واحدا من النهج الأولى المتقدمة لأساية البروتين S-acylation12،13،14. ومع ذلك، الأساليب القائمة على العلامات الإشعاعية الحالية المخاوف الصحية، ليست حساسة جدا، وتستغرق وقتا طويلا، والكشف فقط عن الدهون من البروتينات وفيرة للغاية15. بديل أسرع وغير مشع لوضع العلامات الإشعاعية هو وضع العلامات الأيضية مع تحقيقات الأحماض الدهنية الحيوية، والتي تستخدم بشكل روتيني لتقويم ديناميات البروتين S-acylation16. في هذه الطريقة ، يتم دمج الأحماض الدهنية مع مراسل كيميائي (مجموعة الألكيين أو الأزيد) في البروتين S-acylated بواسطة acyltransferase البروتين. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition التفاعل (انقر الكيمياء) يمكن استخدامها بعد ذلك لإرفاق مجموعة وظيفية، مثل الفلوروفور أو البيوتين، إلى الأحماض الدهنية المتكاملة مما يسمح للكشف عن البروتين S-acylated17،18،19.
Acyl-biotin التبادل (ABE) هي واحدة من الطرق الكيميائية الحيوية المستخدمة على نطاق واسع لالتقاط وتحديد البروتينات S-acylated التي تتجاوز بعض أوجه القصور في وضع العلامات الأيضية مثل عدم ملاءمة لعينات الأنسجة15. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لتحليل S-acylation في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية، بما في ذلك الأنسجة وعينات الخلايا المجمدة20،21. ويستند هذا الأسلوب على الانقسام الانتقائي من السندات ثيويستر بين مجموعة acyl وبقايا السيستين من الهيدروكسيلامين محايدة. ثم يتم التقاط مجموعات ثيول المحررة مع مشتق البيوتين القائم على التفاعل مع ثيول. ثم يتم تنقية البروتينات الحيوية المتولدة باستخدام العقديات وتحليلها بواسطة المناعي.
تم تقديم نهج بديل يسمى acyl-resin بمساعدة القبض (Acyl-RAC) في وقت لاحق لاستبدال خطوة biotinylation مع اقتران مباشر من السيستينات الحرة من قبل راتنج ثيول التفاعلي22،23. هذه الطريقة لديها خطوات أقل بالمقارنة مع ABE وبالمثل يمكن استخدامها للكشف عن البروتين S-acylation في مجموعة واسعة من العينات1.
Acyl-RAC يتكون من 4 خطوات رئيسية(الشكل 1)،
1. حظر مجموعات ثيول الحرة؛
2. الانقسام الانتقائي من السندات ثيويستر السيستين- أسيل مع الهيدروكسيلامين محايدة (HAM) لفضح مجموعات السيستين ثيول;
3. التقاط السيستينات الدهنية مع الراتنج ثيول التفاعلي؛
4. الإثراء الانتقائي للبروتينات S-acylated بعد elution مع الحد من العازلة.
ويمكن بعد ذلك أن يتم تحليل البروتينات التي تم التقاطها عن طريق التنبولين المناعي أو إخضاعها لـ البروتيوميكس القائم على الكتلة (MS) لتقييم البروتيوم S-acylated في مجموعة متنوعة من الأنواع والأنسجة22،24،25. يمكن أيضًا تحديد مواقع S-acylation الفردية عن طريق هضم التربسين للبروتينات الملتقطة وتحليل الببتيدات الناتجة بواسطة LC-MS/MS22. هنا، نوضح كيف يمكن استخدام acyl-RAC للكشف المتزامن عن S-acylation من بروتينات متعددة في كل من خط الخلية وعينة الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نجحنا في استخدام فحص acyl-RAC للكشف عن S-acylation من البروتينات المختارة في كل من الخلايا البشرية المستزرعة والخلايا الأولية المستمدة من أنسجة الماوس. هذه الطريقة بسيطة وحساسة ، ويمكن تنفيذها بسهولة مع الحد الأدنى من متطلبات المعدات باستخدام تقنيات الكيمياء الحيوية القياسية. وقد ثبت أن هذه …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة المنح 5R01GM115446 و 1R01GM130840.
Materials
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets | Sigma | 11836170001 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| Hydroxylamine (HAM) | Sigma | 159417 | |
| Methyl methanethiosulfonate (MMTS) | Sigma | 64306 | |
| Mini tube rotator | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) | Sigma | D641 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
| Ultrasonics Quantrex Sonicator | L & R |
References
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
- Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).
- Fujimoto, T., et al. P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage. Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).
- DeMar, J. C., Anderson, R. E. Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver. Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).
- Montigny, C., et al. S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin. Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).
- Muszbek, L., Laposata, M. Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets. Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).
- Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).
- Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).
- Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids. Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).
- Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck. Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).
- Blanc, M., et al. SwissPalm: Protein Palmitoylation database. F1000Research. 4, 1-23 (2015).
- O’Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).
- Drahansky, M., et al. We are IntechOpen , the world’s leading publisher of Open Access books Built by scientists. Intech. 13, (2016).
- Resh, M. D. Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation. Methods. 40 (2), 191-197 (2006).
- Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).
- Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6, 135-138 (2009).
- Rami, N., Hannoush, N. A. -. R. Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins. ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).
- Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).
- Charron, G., et al. Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters. Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).
- Roth, A. F., et al. Global analysis of protein palmitoylation in yeast. Cell. 125, 1003-1013 (2006).
- Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).
- Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
- Guo, J., et al. Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
- Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).
- Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and activation of murine lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).
- Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative “null” and “T” cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).
- Hundt, M., et al. Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells. Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).
- Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).
- Brdicka, T., et al. Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation. Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).
- Akimzhanov, A. M., Boehning, D. Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).
- Stetsenko, A., Guskov, A. An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), (2017).
- Adibekian, A., et al. Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2). Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).
- Dekker, F. J., et al. Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling. Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).
- Zhou, B., et al. Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis. Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).
