Détection de la protéine S-Acylation à l’aide de capture assistée Acyl-Resin
Summary
Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) est une méthode très sensible, fiable et facile à exécuter pour détecter la modification réversible des lipides des résidus de cystéine (S-acylation) dans une variété d’échantillons biologiques.
Abstract
La protéine S-acylation, également appelée S-palmitoylation, est une modification post-translationnelle réversible des résidus de cystéine avec des acides gras à longue chaîne par l’intermédiaire d’un lien de thioester labile. La s-acylation, qui apparaît comme un mécanisme de régulation répandu, peut moduler presque tous les aspects de l’activité biologique des protéines, de la formation complexe au trafic de protéines et à la stabilité des protéines. Les progrès récents dans la compréhension de la fonction biologique de la protéine S-acylation ont été réalisés en grande partie grâce au développement de nouveaux outils biochimiques permettant la détection robuste et sensible de la protéine S-acylation dans une variété d’échantillons biologiques. Ici, nous décrivons la capture assistée par la résine d’acyl (Acyl-RAC), une méthode récemment développée basée sur la capture sélective des protéines endogènes S-acylated par des perles de Sepharose thiol-réactives. Par rapport aux approches existantes, Acyl-RAC nécessite moins d’étapes et peut produire des résultats plus fiables lorsqu’il est couplé avec la spectrométrie de masse pour l’identification de nouvelles cibles D’acylation S. Une limitation majeure dans cette technique est le manque de capacité à discriminer entre les espèces d’acides gras attachés aux cystéines par le même lien de thioester.
Introduction
S-acylation est une modification post-translationnelle réversible impliquant l’ajout d’une chaîne d’acyl gras à un résidu interne de cystéine sur une protéine cible via un lien de thioester labile1. Il a d’abord été rapporté comme une modification des protéines avec le palmitate, un acide gras saturé de 16-carbone2, et donc cette modification est souvent appelée S-palmitoylation. En plus du palmitate, les protéines peuvent être modifiées de façon réversible par une variété d’acides gras saturés plus longs et plus courts (myristate et stéarate), monoinsaturés (oleate) et polyinsaturés (arachidonate et eicosapentanoate)3,4,5,6,7. Dans les cellules eucaryotes, S-acylation est catalysée par une famille d’enzymes connues sous le nom d’acyltransferases de protéines DHHC et la réaction inverse de la déphalatation de la cystéine est catalysée par des thioesterases protéiques, dont la plupart restent énigmatiques8.
La labilité du lien thioester rend cette modification lipidique réversible, lui permettant de réguler dynamiquement le regroupement des protéines, la localisation de membrane plasmatique, le trafic intracellulaire, les interactions protéines-protéines et la stabilité protéique9,10. Par conséquent, la S-acylation a été liée à plusieurs troubles, y compris la maladie de Huntington, la maladie d’Alzheimer et plusieurs types de cancer (prostate, gastrique, vessie, poumon, colorectal), qui nécessite le développement de méthodes fiables pour détecter cette modification de protéine post-translationnelle11.
L’étiquetage métabolique avec le palmitate radioactif([3H], [14C] ou [125I]) a été l’une des premières approches développées pour assayer la protéine S-acylation12,13,14. Cependant, les méthodes radio-étiquetées présentent des problèmes de santé, ne sont pas très sensibles, prennent beaucoup de temps, et ne détectent la lipidation des protéines très abondantes15. Une alternative plus rapide et nonradioactive à la radiolabeling est l’étiquetage métabolique avec des sondes d’acides gras bioorthogonal, qui est utilisé régulièrement pour assayer la dynamique de la protéine S-acylation16. Dans cette méthode, un acide gras avec un journaliste chimique (alkyne ou groupe d’azide) est incorporé dans la protéine S-acylated par une ayltransferase de protéine. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaction (click chemistry) peut alors être utilisé pour attacher un groupe fonctionnalisé, comme un fluorophore ou une biotine, à l’acide gras intégré permettant la détection de la protéine S-acylé17,18,19.
L’échange d’acyl-biotine (ABE) est l’une des méthodes biochimiques largement utilisées pour la capture et l’identification des protéines sycylées qui contourne certaines des lacunes de l’étiquetage métabolique tels que l’inadapté pour les échantillons de tissus15. Cette méthode peut être appliquée pour l’analyse de l’acylation S dans une gamme variée d’échantillons biologiques, y compris les tissus et les échantillons de cellules congelées20,21. Cette méthode est basée sur le clivage sélectif du lien de thioester entre le groupe d’acyl et le résidu de cystéine par hydroxylamine neutre. Les groupes de thiol libérés sont ensuite capturés avec un dérivé de la biotine thiol-réactif. Les protéines biotinylated générées sont alors affinity-purified utilisant l’agarose de streptavidine et analysées par immunoblotting.
Une approche alternative appelée capture assistée acyl-résine (Acyl-RAC) a été plus tard introduite pour remplacer l’étape de biotinylation par la conjugaison directe des cystéines libres par une résine thiol-réactive22,23. Cette méthode a moins d’étapes par rapport à ABE et peut également être utilisé pour détecter la protéine S-acylation dans un large éventail d’échantillons1.
Acyl-RAC se compose de 4 étapes principales (figure 1),
1. Blocage des groupes de thiol libres;
2. Clivage sélectif du lien cystéine-acyl thioester avec l’hydroxylamine neutre (HAM) pour exposer les groupes de thiol de cystéine ;
3. Capturer les cystéines lipidées avec une résine thiol-réactive ;
4. Enrichissement sélectif des protéines S-acylated après l’elution avec la réduction du tampon.
Les protéines capturées peuvent ensuite être analysées par immunoblotting ou soumises à la protéomique basée sur la spectrométrie de masse (SEP) pour évaluer le protéome S-acylé dans une gamme variée d’espèces et de tissus22,24,25. Les sites individuels d’acylation de S peuvent également être identifiés par la digestion de trypsine des protéines capturées et l’analyse des peptides résultants par LC-MS/MS22. Ici, nous démontrons comment l’acyl-RAC peut être employé pour la détection simultanée de S-acylation des protéines multiples dans une ligne cellulaire et un échantillon de tissu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons utilisé avec succès l’essai acyl-RAC pour détecter l’acylation S de certaines protéines dans les cellules humaines cultivées et les cellules primaires dérivées du tissu de souris. Cette méthode est simple, sensible, et peut être facilement effectuée avec des exigences minimales d’équipement en utilisant des techniques de biochimie standard. Il a été démontré que cette méthode identifie avec succès de nouvelles protéines S-acylated telles que le sous-unité du système de translocat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par les subventions des National Institutes of Health 5R01GM115446 et 1R01GM130840.
Materials
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets | Sigma | 11836170001 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| Hydroxylamine (HAM) | Sigma | 159417 | |
| Methyl methanethiosulfonate (MMTS) | Sigma | 64306 | |
| Mini tube rotator | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) | Sigma | D641 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
| Ultrasonics Quantrex Sonicator | L & R |
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