זיהוי חלבון S-אכלציה באמצעות לכידת הסיוע Acylation-שרף

Summary

Acyl-מירוץ (acyl-שרף בסיוע לכידת) הוא רגיש מאוד, אמין וקל לבצע שיטה לזיהוי שינוי השומנים הפיך של שאריות ציסטאין (S-acyl) במגוון של דגימות ביולוגיות.

Abstract

חלבון s-אכלציה, המכונה גם S-palmitoylation, הוא שינוי הפיך לאחר ההעברה של שאריות ציסטאין עם חומצות שומן ארוכות בשרשרת באמצעות בונד לבנה thioester. S-אכלציה, המתעוררים כמנגנון הרגולציה הנרחב, יכול לווסת כמעט את כל ההיבטים של הפעילות הביולוגית של חלבונים, מפני היווצרות מורכבים לסחר בחלבונים ויציבות חלבונים. ההתקדמות האחרונה להבנת התפקוד הביולוגי של חלבון S-אכלציה הושגה בעיקר בשל התפתחות הכלים הביוכימיים החדשניים המאפשרים גילוי חזק ורגיש של חלבון S-אכלציה במגוון דגימות ביולוגיות. כאן, אנו מתארים לכידה בסיוע של acyl שרף (Acyl-מירוץ), שיטה שפותחה לאחרונה מבוסס על לכידת סלקטיבי של חלבונים S-acylated על ידי החרוזים הספרדית thiol-תגובתי. לעומת הגישות הקיימות, Acyl-מירוץ דורש פחות שלבים והוא יכול להניב תוצאות אמינות יותר כאשר ביחד עם ספקטרומטר המסה לזיהוי מטרות הרומן S-אכלציה. מגבלה מרכזית בטכניקה זו היא חוסר יכולת להפלות בין מינים של חומצת שומן המחוברים לציסטרינס באמצעות אותו קשר.

Introduction

S-אכלציה הוא שינוי הפיך לאחר ההעברה מעורבים תוספת של שרשרת acylation שומן לשאריות ציסטאין פנימי על חלבון היעד באמצעות בונד לבנה thioester¹. הוא דווח לראשונה כשינוי של חלבונים עם palmitate, חומצה שומן רווי 16 פחמן², ולכן שינוי זה מכונה לעתים קרובות S-palmitoyלציה. בנוסף palmitate, חלבונים יכולים להיות שונה למדי על ידי מגוון רחב יותר וקצר יותר רווי (myristate ו stearate), חד (oleate) ו רב בלתי רווי (ארכאידיט ו eאיסאופנטאנואט) חומצות שומן^3,4,5,6,7. בתאי איקריוטית, S-אכלציה הוא מזרז על ידי משפחה של אנזימים המכונה acyltransferחלבונים החלבון ואת התגובה הפוכה של ציסטאין דאכלציה הוא מזרז על ידי חלבון החלבונים, שרובם עדיין להישאר המסתורית⁸.

היכולת של הקשר thioester עושה את זה שינוי השומנים הפיך, המאפשר לו להסדיר באופן דינאמי באשכולות חלבון, פלזמה ממברנה לוקליזציה, סחר תאיים, אינטראקציות חלבונים חלבון ויציבות חלבון^9,10. כתוצאה מכך, S-אכלציה נקשר להפרעות מספר כולל מחלת הנטינגטון, מחלת אלצהיימר ומספר סוגים של סרטן (ערמונית, קיבה, שלפוחית השתן, ריאות, המעי הגס), אשר מחייב פיתוח של שיטות אמינות לזהות את שינוי החלבון הפוסט-טרנסלסטי¹¹.

מטבולית תיוג עם רדיואקטיבי ([³H],^[14ג] או [¹²⁵אני]) palmitate היתה אחת הגישות הראשונות שפותחו כדי לשנות את החלבון S-אכלציה^12,13,14. עם זאת, שיטות מבוססות רדיואולבלינג מציגים חששות בריאותיים, הם לא רגישים מאוד, זמן רב, ורק לגלות lipidation של חלבונים שופע מאוד¹⁵. חלופה מהירה ולא רדיואקטיבית radiolabeling היא תיוג מטבולית עם בדיקה חומצות שומן bioorthogonal, אשר משמש באופן שגרתי כדי שיטת הדינמיקה של חלבון S-אכלציה¹⁶. בשיטה זו, חומצת שומן עם כתב כימי (הקבוצה האלבית או עזידה) משולבים בחלבון S-acylated על ידי חלבון acyltransferase. התגובה של עזידה-אלקין (לחץ על כימיה) יכולה לשמש לחיבור קבוצה פונקציונליזציה, כגון fluorophore או biotin, לחומצת השומן המשולבת המאפשרת זיהוי של חלבון ה-S-acylated^17,18,19.

Acyl-ביוטין החליפין (אייב) היא אחת השיטות הביוכימי בשימוש נרחב לכידה וזיהוי של חלבונים S-acylated העוקף כמה חסרונות של תיוג מטבולית כגון חוסר התאמה לדגימות רקמות¹⁵. ניתן ליישם שיטה זו לניתוח S-acylation במגוון מגוון של דגימות ביולוגיות, כולל רקמות ודגימות תאים קפואים^20,21. שיטה זו מבוססת על מחשוף סלקטיבי של הקשר בין הקבוצה acyl ושאריות ציסטאין על ידי הידרוקסילאמין נייטרלי. הקבוצות המשוחררות שוחררו לאחר מכן באמצעות הנגזרת הביוטין התגובתית. חלבונים biotinylated שנוצר לאחר מכן מטוהרים אהדה באמצעות streptavidin agarose ונותחו על ידי החיסונית.

גישה חלופית הנקראת acyl שרף בסיוע לכידת (acyl מירוץ) הוצגה מאוחר יותר להחליף את הצעד biotinylation עם בניינים ישירים של cysteines חינם על ידי שרף thiol-תגובתי^22,23. שיטה זו יש פחות צעדים לעומת אייב ובאופן דומה ניתן להשתמש כדי לזהות חלבון S-אכלציה במגוון רחב של דגימות¹.

Acyl-מירוץ מורכב 4 צעדים עיקריים (איור 1),
1. חסימת קבוצות תיול חינם;
2. מחשוף סלקטיבי של בונד של ציסטאין thioester עם הידרוקסילין נייטרלי (HAM) לחשוף את הקבוצות ציסטאין.
3. לכידת cysteines הליפינס עם שרף מגיב thiol;
4. העשרה סלקטיבית של חלבוני S-acylated לאחר הימנעות עם הפחתת מאגר.

את החלבונים שנתפסו ניתן לנתח על ידי חיסוני או נתון המסה ספקטרומטריה (MS) מבוסס פרוטאומניקס להעריך את S-acylated פרוטדום במגוון מגוון של מינים ורקמות^22,24,25. אתרים בודדים S-אכלציה ניתן גם לזהות על ידי טריפסין העיכול של חלבונים שנתפסו ניתוח של פפטידים הנובעים על ידי LC-MS/MS²². כאן, אנו מדגימים כיצד acyl מירוץ יכול לשמש זיהוי סימולטני של S-האכלציה של חלבונים מרובים הן בקו התא וגם דגימת רקמה.

Protocol

עכברים המשמשים בפרוטוקול זה הורדמים על פי הנחיות NIH. הוועדה לרווחת בעלי חיים באוניברסיטת טקסס מדעי הבריאות המרכז ביוסטון אישר את כל העבודה בעלי חיים. 1. הכנת ליקוטים סלולריים הכן את מאגר הליזה כמתואר בטבלה 1. כדי 10 mL של PBS, להוסיף 0.1 g של n-dodecyl β-D-מלטוסייד אבקת כביס…

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, השתמשנו הראשון acyl-מירוץ כדי לזהות בו S-אכלציה של כמה חלבונים בתאים ורנל, קו תא T הונצח במקור נגזר דם היקפי של חולה לוקמיה של תא T27. החלבונים של תא T הרגולציה שזוהו בעבר כ-S-acylated9,28,29 נבחרו כדי להדגים את…

Discussion

כאן, אנו מנוצל בהצלחה את הבחינה מירוץ acyl כדי לזהות S-אכלציה של חלבונים שנבחרו בתאי האדם התרבותי הן התאים הראשוניים הנגזרים מרקמת העכבר. שיטה זו היא פשוטה, רגישה, ניתן לבצע בקלות עם דרישות ציוד מינימלי באמצעות טכניקות ביוכימיה סטנדרטית. שיטה זו הוצגה בהצלחה לזהות חלבונים S-acylated הרומן כגון β-su…

Materials

cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets	Sigma	11836170001
Eppendorf Centrifuge 5424	Eppendorf	22620444
Hydroxylamine (HAM)	Sigma	159417
Methyl methanethiosulfonate (MMTS)	Sigma	64306
Mini tube rotator	LabForce
ML211	Cayman	17630
Multi-Therm Cool-Heat-Shake	Benchmark Scientific	H5000-HC
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM)	Sigma	D641
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5726
Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)	Sigma	T8387
Ultrasonics Quantrex Sonicator	L & R