Acyl-राल सहायता प्राप्त कब्जा का उपयोग कर प्रोटीन एस-Acylation का पता लगाने
Summary
Acyl-आरएसी (Acyl-Resin असिस्टेड कैप्चर) विभिन्न प्रकार के जैविक नमूनों में साइस्टीन अवशेषों (एस-एसिलेशन) के रिवर्सिबल लिपिड संशोधन का पता लगाने के लिए विधि करने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील, विश्वसनीय और आसान है।
Abstract
प्रोटीन एस-एसिलेशन, जिसे एस-पामिटोइलेशन भी कहा जाता है, एक लेबिल थिओस्टर बॉन्ड के माध्यम से लंबी श्रृंखला फैटी एसिड के साथ साइस्टीन अवशेषों का एक रिवर्सिबल पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है। एस-acylation, जो एक व्यापक नियामक तंत्र के रूप में उभर रहा है, प्रोटीन की जैविक गतिविधि के लगभग सभी पहलुओं को मिलाना कर सकते हैं, जटिल गठन से प्रोटीन तस्करी और प्रोटीन स्थिरता के लिए । प्रोटीन एस-एसिलेशन के जैविक कार्य की समझ में हाल की प्रगति मुख्यतः उपन्यास जैव रासायनिक उपकरणों के विकास के कारण हासिल की गई थी, जिससे विभिन्न प्रकार के जैविक नमूनों में प्रोटीन एस-एसिलेशन का मजबूत और संवेदनशील पता लगाया जा सकता है। यहां, हम एसिल रेसिन-असिस्टेड कैप्चर (Acyl-आरएसी) का वर्णन करते हैं, जो हाल ही में विकसित विधि है जो थिओल-प्रतिक्रियाशील सेफलोस मोतियों द्वारा एंडोजेन्सी एस-एसाइटेड प्रोटीन के चयनात्मक कैप्चर पर आधारित है। मौजूदा दृष्टिकोणों की तुलना में, Acyl-RAC कम कदम की आवश्यकता है और अधिक विश्वसनीय परिणाम उपज जब उपन्यास एस-acylation लक्ष्यों की पहचान के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर कर सकते हैं । इस तकनीक में एक प्रमुख सीमा एक ही thioester बांड के माध्यम से cysteines से जुड़ी फैटी एसिड प्रजातियों के बीच भेदभाव करने की क्षमता की कमी है ।
Introduction
एस-एसिलेशन एक रिवर्सिबल पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है जिसमें एक लेबिल थिओस्टर बॉन्ड1के माध्यम से एक लक्ष्य प्रोटीन पर एक आंतरिक साइस्टीन अवशेषों में फैटी एसिल श्रृंखला को जोड़ना शामिल है। यह पहली बार palmitate, एक संतृप्त 16 कार्बन फैटी एसिड2के साथ प्रोटीन के संशोधन के रूप में सूचित किया गया था, और इसलिए इस संशोधन अक्सर एस-palmitoylation के रूप में संदर्भित किया जाता है । पाजिटेट के अलावा, प्रोटीन को विभिन्न प्रकार के लंबे और छोटे संतृप्त (माइरिस्टेट और स्टीरेट), मोनोअनसैचुरेटेड (ओलेट) और पॉलीअनसैचुरेटेड (अराचिदान और आइकोसैपेंटानोएट) फैटी एसिड3,,4,,55,6,,7द्वारा प्रतिवर्तित रूप से संशोधित किया जा सकता है। यूकेरियोटिक कोशिकाओं में, एस-एसिलेशन को डीएचसी प्रोटीन एसिलट्रांसफरेस के नाम से जाने जाने वाले एंजाइमों के परिवार द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है और साइस्टीन डीसिलेशन की रिवर्स प्रतिक्रिया प्रोटीन थिओस्टेरेनेस द्वारा उत्प्रेरित होती है, जिनमें से अधिकांश अभी भी रहस्यपूर्ण8रहते हैं।
थिओएस्टर बॉन्ड की लेबिलिटी इस लिपिड संशोधन को उलटा बनाती है, जिससे यह प्रोटीन क्लस्टरिंग, प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण, इंट्रासेलर ट्रैफिकिंग, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और प्रोटीन स्थिरता9,,10को गतिशील रूप से विनियमित कर सकता है । नतीजतन, एस-acylation हंटिंगटन रोग, अल्जाइमर रोग और कैंसर के कई प्रकार (प्रोस्टेट, गैस्ट्रिक, मूत्राशय, फेफड़ों, कोलोरेक्टल) सहित कई विकारों से जोड़ा गया है, जो विश्वसनीय तरीकों के विकास के लिए इस के बाद अनुवाद प्रोटीन संशोधन11का पता लगाने की आवश्यकता है ।
रेडियोधर्मी([3एच],[14सी] या[125I]) के साथ मेटाबोलिक लेबलिंग प्रोटीन एस-एसिलेशन12,,13,,14परख के लिए विकसित पहले दृष्टिकोणों में से एक थी। हालांकि, रेडियोलेबलिंग आधारित तरीके स्वास्थ्य चिंताओं को पेश करते हैं, बहुत संवेदनशील नहीं हैं, समय लेने वाली हैं, और केवल अत्यधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन15के लिपिडेशन का पता लगाते हैं। रेडियोलेबलिंग के लिए एक तेज और गैर रेडियोधर्मी विकल्प बायोऑर्थोगोनल फैटी एसिड जांच के साथ मेटाबोलिक लेबलिंग है, जिसका उपयोग नियमित रूप से प्रोटीन एस-एसिलेशन16की गतिशीलता को परख करने के लिए किया जाता है। इस विधि में, एक रासायनिक रिपोर्टर (एल्किन या अजाइड समूह) के साथ एक फैटी एसिड को प्रोटीन एसिलट्रांसफरेज द्वारा एस-एसाइटेड प्रोटीन में शामिल किया जाता है। अजाइड-अल्किन ह्यूज़न साइक्लोएडिक्शन रिएक्शन (क्लिक केमिस्ट्री) का उपयोग एक कार्यात्मक समूह को संलग्न करने के लिए किया जा सकता है, जैसे फ्लोरोफोर या बायोटिन, एकीकृत फैटी एसिड में, जो एस-एसाइटेड प्रोटीन17,,18,,19का पता लगाने की अनुमति देता है।
Acyl-biotin एक्सचेंज (ABE) एस-acylated प्रोटीन की कैप्चर और पहचान के लिए बड़े पैमाने पर उपयोग किए जाने वाले जैव रासायनिक तरीकों में से एक है जो ऊतक नमूनों के लिए अनुपयुक्तता जैसे मेटाबोलिक लेबलिंग की कुछ कमियों को दरकिनार करता है15। इस विधि को विभिन्न जैव नमूनों में एस-एसिलेशन के विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है, जिसमें ऊतक और जमे हुए सेल नमूने शामिल हैं,जिनमें 20,,21 शामिलहैं। यह विधि एसिल समूह और तटस्थ हाइड्रोक्सिलमाइन द्वारा साइस्टीन अवशेषों के बीच थिओस्टर बांड के चयनात्मक दरार पर आधारित है। इसके बाद मुक्त थिओल समूहों को थिओल-रिएक्टिव बायोटिन डेरिवेटिव के साथ कैप्चर किया जाता है । उत्पन्न बायोटिनी प्रोटीन तब स्ट्रेप्टाविडिन अगारोज का उपयोग करके आत्मीयता-शुद्ध होते हैं और इम्यूनोलोटिंग द्वारा विश्लेषण किया जाता है।
बाद में एक वैकल्पिक दृष्टिकोण को एक थिओल-रिएक्टिव रिसिन22,,23द्वारा मुफ्त साइस्टीन के प्रत्यक्ष संयोजन के साथ बायोटिनीलेशन कदम को बदलने के लिए शुरू किया गया था । इस विधि में आबे की तुलना में कम कदम हैं और इसी तरह नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रोटीन एस-एसिलेशन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जा सकता है1।
Acyl-आरएसी 4 मुख्य चरणों के होते हैं(चित्रा 1),
1. मुक्त थिओल समूहों को अवरुद्ध करना;
2. साइस्टीन थिओल माइन (एचएच) के साथ साइस्टीन-एसिल थिओस्टर बॉन्ड का चयनात्मक दरार साइस्टीन थिओल समूहों को बेनकाब करने के लिए;
3. थिओल-रिएक्टिव रिसिज़न के साथ लिपिडाय साइस्टीन ्स पर कब्जा;
4. बफर को कम करने के साथ एल्यूशन के बाद एस-एसाइटेड प्रोटीन का चयनात्मक संवर्धन।
इसके बाद पकड़े गए प्रोटीन का विश्लेषण इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा किया जा सकता है या बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित प्रोटेओमिक्स के अधीन किया जा सकता है ताकि विभिन्न प्रजातियों और ऊतकों में एस-एसाइटेटेड प्रोटेम का आकलन किया जा सके22,24,25। व्यक्तिगत एस-एसिलेशन साइटों को कैप्चर किए गए प्रोटीन के ट्राइप्सिन पाचन और एलसी-एमएस/एमएस22द्वारा परिणामी पेप्टाइड्स के विश्लेषण द्वारा भी पहचाना जा सकता है। यहां, हम प्रदर्शित करते हैं कि कोशिका रेखा और ऊतक नमूने दोनों में कई प्रोटीन के एस-acyation का एक साथ पता लगाने के लिए acyl-RAC का उपयोग कैसे किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हमने माउस ऊतक से प्राप्त सुसंस्कृत मानव कोशिकाओं और प्राथमिक कोशिकाओं दोनों में चयनित प्रोटीन के एस-acylation का पता लगाने के लिए acyl-RAC परख का सफलतापूर्वक उपयोग किया। यह विधि सरल, संवेदनशील है, और मानक जै?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान 5R01GM115446 और 1R01GM130840 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets | Sigma | 11836170001 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| Hydroxylamine (HAM) | Sigma | 159417 | |
| Methyl methanethiosulfonate (MMTS) | Sigma | 64306 | |
| Mini tube rotator | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) | Sigma | D641 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
| Ultrasonics Quantrex Sonicator | L & R |
References
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
- Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).
- Fujimoto, T., et al. P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage. Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).
- DeMar, J. C., Anderson, R. E. Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver. Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).
- Montigny, C., et al. S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin. Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).
- Muszbek, L., Laposata, M. Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets. Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).
- Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).
- Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).
- Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids. Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).
- Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck. Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).
- Blanc, M., et al. SwissPalm: Protein Palmitoylation database. F1000Research. 4, 1-23 (2015).
- O’Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).
- Drahansky, M., et al. We are IntechOpen , the world’s leading publisher of Open Access books Built by scientists. Intech. 13, (2016).
- Resh, M. D. Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation. Methods. 40 (2), 191-197 (2006).
- Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).
- Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6, 135-138 (2009).
- Rami, N., Hannoush, N. A. -. R. Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins. ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).
- Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).
- Charron, G., et al. Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters. Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).
- Roth, A. F., et al. Global analysis of protein palmitoylation in yeast. Cell. 125, 1003-1013 (2006).
- Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).
- Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
- Guo, J., et al. Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
- Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).
- Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and activation of murine lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).
- Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative “null” and “T” cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).
- Hundt, M., et al. Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells. Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).
- Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).
- Brdicka, T., et al. Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation. Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).
- Akimzhanov, A. M., Boehning, D. Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).
- Stetsenko, A., Guskov, A. An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), (2017).
- Adibekian, A., et al. Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2). Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).
- Dekker, F. J., et al. Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling. Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).
- Zhou, B., et al. Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis. Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).
