Rilevamento di Protein S-Acylation utilizzando Acyl-Resin Assisted Capture

Summary

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) è un metodo altamente sensibile, affidabile e facile da eseguire per rilevare la modifica reversibile dei lipidi dei residui di cisteina (S-acylation) in una varietà di campioni biologici.

Abstract

Protein S-acylation, noto anche come S-palmitoylation, è una modifica post-traduzionale reversibile dei residui di cisteina con acidi grassi a catena lunga tramite un legame di tioestro labile. La S-acylation, che sta emergendo come un meccanismo regolatore diffuso, può modulare quasi tutti gli aspetti dell’attività biologica delle proteine, dalla formazione complessa al traffico di proteine e alla stabilità delle proteine. I recenti progressi nella comprensione della funzione biologica della proteina S-acylation sono stati raggiunti in gran parte grazie allo sviluppo di nuovi strumenti biochimici che consentono il rilevamento robusto e sensibile della proteina S-acylation in una varietà di campioni biologici. Qui, descriviamo la cattura assistita da resina acilosa (Acyl-RAC), un metodo recentemente sviluppato basato sulla cattura selettiva di proteine endogeneamente Aclaate con perline sepharose thiol-reattive. Rispetto agli approcci esistenti, Acyl-RAC richiede meno passaggi e può produrre risultati più affidabili se accoppiato con spettrometria di massa per l’identificazione di nuovi obiettivi S-acylation. Una delle principali limitazioni di questa tecnica è la mancanza di capacità di discriminare tra le specie di acidi grassi attaccate ai cistein attraverso lo stesso legame di tiopee.

Introduction

La S-acylation è una modifica post-traduzionale reversibile che comporta l’aggiunta di una catena di acili grassi a un residuo di cisteina interno su una proteina bersaglio tramite un legame di tioestro labile¹. È stato segnalato per la prima volta come una modifica delle proteine con palmitate, un acido grasso 16-carbonio saturo², e quindi questa modifica è spesso indicata come S-palmitoylation. Oltre al palmitato, le proteine possono essere reversibilmente modificate da una varietà di acidi grassi più lunghi e più brevi saturi (miristata e stearate), monoinsaturi (oleati) e polinsaturi (arachidonate ed eicosapentanoa)^acidigrassi 3^,4,5,6,7. Nelle cellule eucariotiche, la S-acylation è catalizzata da una famiglia di enzimi noti come acyltransferesteraes proteici DHHC e la reazione inversa della deacylazione dei cistein è catalizzata da tiosi proteici, la maggior parte dei quali rimangono ancora enigmatici⁸.

La leggibilità del legame di tioestro rende reversibile questa modifica dei lipidi, permettendogli di regolare dinamicamente il clustering proteico, la localizzazione della membrana plasmatica, il traffico intracellulare, le interazioni proteina-proteina e la stabilità proteica^9,10. Di conseguenza, l’acilazione scisa è stata collegata a diversi disturbi tra cui la Malattia di Huntington, il morbo di Alzheimer e diversi tipi di cancro (prostata, gastrica, vescica, polmone, colorettale), che richiede lo sviluppo di metodi affidabili per rilevare questa modifica delle proteine post-traduzionale¹¹.

L’etichettatura metabolica con palmita radioattiva ([³H], [¹⁴C] o [¹²⁵I]) è stato uno dei primi approcci sviluppati per formulare la proteina S-acylation^12,13,14. Tuttavia, i metodi basati sulla radioetichettatura presentano problemi di salute, non sono molto sensibili, richiedono molto tempo e rilevano solo la lipidazione di proteine altamente abbondanti¹⁵. Un’alternativa più veloce e non radioattiva alla radioetichettatura è l’etichettatura metabolica con sonde di acidi grassi bioortogonali, che viene utilizzata regolarmente per testare la dinamica della proteina S-acylation¹⁶. In questo metodo, un acido grasso con un reporter chimico (gruppo alchine o azide) è incorporato nella proteina S-acilato da un acyltransferase proteico. La reazione di cicloaddition Azide-alkyne Huisgen (chimica del clic) può quindi essere utilizzata per attaccare un gruppo funzionato, come un fluoroforo o biotina, all’acido grasso integrato che consente di rilevare la proteina S-acilata^17,18,19.

Lo scambio di acyl-biotin (ABE) è uno dei metodi biochimici ampiamente utilizzati per la cattura e l’identificazione di proteine S-acylated che bypassa alcune delle carenze dell’etichettatura metabolica come l’inadeguatezza per i campioni di tessuto¹⁵. Questo metodo può essere applicato per l’analisi di S-acylation in una vasta gamma di campioni biologici, tra cui tessuti e campioni di cellule congelate^20,21. Questo metodo si basa sulla scissione selettiva del legame tra il gruppo acileere e il residuo di cisteina da idrossilamina neutra. I gruppi tioli liberati vengono poi catturati con un derivato della biotina thiol-reattiva. Le proteine biotinylate generate vengono quindi purificate dall’affinità con streptavidin agarose e analizzate mediante immunoblotting.

Un approccio alternativo chiamato acyl-resina assistita capture (Acyl-RAC) è stato successivamente introdotto per sostituire la fase di biotinylazione con coniugazione diretta di cistein liberi da una resina thiol-reattiva^22,23. Questo metodo ha meno passaggi rispetto ad ABE e allo stesso modo può essere utilizzato per rilevare proteina S-acylation in una vasta gamma di campioni¹.

Acyl-RAC è costituito da 4 passaggi principali (Figura 1),
1. Blocco dei gruppi di thiol liberi;
2. Scissione selettiva del legame cisteina-acilo con idrossilamina neutra (HAM) per esporre i gruppi di cisteina;
3. Cattura dei cistein lipidati con una resina thiol-reattiva;
4. Arricchimento selettivo delle proteine aclatato da S dopo l’eluizione con riduzione del tampone.

Le proteine catturate possono quindi essere analizzate mediante immunoblotting o sottoposte a proteometria di massa (MS) per valutare il proteoma aclato da S in una vasta gamma di specie e tessuti^22,24,25. I singoli siti di S-acylation possono anche essere identificati mediante la digestione della trypsin acquisizione delle proteine catturate e l’analisi dei peptidi risultanti da LC-MS/MS²². Qui, dimostriamo come acyl-RAC può essere utilizzato per il rilevamento simultaneo di S-acylation di più proteine sia in una linea cellulare che in un campione di tessuto.

Protocol

I topi utilizzati in questo protocollo sono stati eutanasiati secondo le linee guida NIH. L’Animal Welfare Committee dell’Università del Texas Health Science Center di Houston ha approvato tutto il lavoro sugli animali. 1. Preparazione dei lismi cellulari Preparare il buffer di lisi come descritto nella tabella 1. A 10 mL di PBS, aggiungere 0,1 g di detergente n-dodecyl (DDM) e ruotare per sciogliere. Aggiungete 100 l di fosphatase inhibitor cocktail 2, ML211 (10 m)…

Representative Results

Seguendo il protocollo descritto sopra, abbiamo usato per la prima volta acyl-RAC per rilevare simultaneamente l’acilazione S di diverse proteine nelle cellule Jurkat, una linea cellulare T immortalata originariamente derivata dal sangue periferico di un paziente con leucemia delle cellule T27. Proteine cellulari T regolatorie precedentemente identificate come S-acylated9,28,29 sono stati scelti per dimos…

Discussion

Qui, abbiamo utilizzato con successo il saggio acyl-RAC per rilevare l’acilazione S di proteine selezionate sia nelle cellule umane coltivate che nelle cellule primarie derivate dal tessuto del topo. Questo metodo è semplice, sensibile e può essere facilmente eseguito con requisiti minimi di attrezzatura utilizzando tecniche di biochimica standard. È stato dimostrato che questo metodo identifica con successo nuove proteine S-acilato, come la sottounità z del sistema di traslocazione delle proteine (Sec61b), la protei…

Materials

cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets	Sigma	11836170001
Eppendorf Centrifuge 5424	Eppendorf	22620444
Hydroxylamine (HAM)	Sigma	159417
Methyl methanethiosulfonate (MMTS)	Sigma	64306
Mini tube rotator	LabForce
ML211	Cayman	17630
Multi-Therm Cool-Heat-Shake	Benchmark Scientific	H5000-HC
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM)	Sigma	D641
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5726
Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)	Sigma	T8387
Ultrasonics Quantrex Sonicator	L & R