アシル樹脂アシスト捕捉によるプロテインS-アシル化の検出
Summary
Acyl-RAC(アシル-レジンアシストキャプチャ)は、様々な生物学的サンプル中のシステイン残基の可逆的脂質修飾(S-acylation)を検出する方法を非常に敏感で、信頼性が高く、実行しやすいです。
Abstract
プロテインS-アシル化は、S-パルミトイル化とも呼ばれ、陰茎チオエステル結合を介して長鎖脂肪酸を有するシステイン残基の可逆的な翻訳後修飾である。広範囲にわたる調節機構として出現するS-acylationは、複雑な形成からタンパク質の密売およびタンパク質安定性に至る、タンパク質の生物学的活性のほぼすべての側面を調節することができる。タンパク質S-アシル化の生物学的機能の理解の最近の進歩は、様々な生物学的サンプルにおけるタンパク質S-acylationの堅牢かつ敏感な検出を可能にする新しい生化学的ツールの開発によって大きく達成された。ここでは、チオール反応性セファロースビーズによる内因性S-acylatedタンパク質の選択的捕捉に基づく最近開発された方法であるアシル樹脂支援捕捉(Acyl-RAC)について述べている。既存のアプローチと比較して、Acyl-RACは、より少ないステップを必要とし、新しいS-アシル化ターゲットの同定のための質量分析と結合された場合、より信頼性の高い結果を得ることができます。この技術の主な制限は、同じチオスター結合を介してシステインに結合した脂肪酸種を区別する能力の欠如である。
Introduction
S-アシル化は、陰唇チオエステル結合1を介して標的タンパク質上のシステイン残基に脂肪アシル鎖を付加することを含む可逆的な翻訳後修飾である。それはパルミテ酸塩、飽和16-炭素脂肪酸2を有するタンパク質の修飾として最初に報告された、したがって、この修飾は、しばしばS-パルミトイル化と呼ばれる。パルミチン酸に加えて、タンパク質は、様々な長く短い飽和(ミリステイトおよびステアレート)、一価不飽和(オレ酸塩)および多価不飽和(アラキドキおよびエイコサペンタノエート)脂肪酸33、4、5、6、74,5,6,7によって可逆的に修飾することができる。真核細胞において、S-アシル化はDHHCタンパク質アシルトランスセラーゼとして知られる酵素ファミリーによって触媒され、システイン脱アシル化の逆反応はタンパク質チオエステラーゼによって触媒され、そのほとんどは依然として謎8のままである。
チオスター結合の可射性により、この脂質修飾を可逆的にし、タンパク質のクラスタリング、細胞質膜局在、細胞内の密売、タンパク質相互作用およびタンパク質安定性99,1010を動的に調節することを可能にする。その結果、S-アシル化は、ハンチントン病、アルツハイマー病およびいくつかのタイプの癌(前立腺癌、胃、膀胱、肺、大腸)を含むいくつかの障害に関連しており、この翻訳後タンパク質改変11を検出するための信頼できる方法の開発を必要とする。
パルミテは、放射性([3H]、14C)または3[125I])を用いた代謝標識は、タンパク質S-アシル化12、13、14,13,をアッセイするために開発された最初のアプローチの1つである。14しかしながら、放射線標識ベースの方法は健康上の懸念を提示し、非常に敏感ではなく、時間がかかり、そして非常に豊富なタンパク質15の脂質を検出するだけである。放射性標識に対するより速く非放射性の代替は、生体直交脂肪酸プローブによる代謝標識であり、これはタンパク質S-アシル化16の測定ダイナミクスをアッセイするために日常的に使用される。この方法では、化学レポーターを有する脂肪酸(アルキンまたはアジ化基)を、アシルトランスファーーゼタンパク質によってS-acylatedタンパク質に組み込む。アジドアルキン・ウイスゲン・シクロ付加反応(クリック化学)は、フッ素酸またはビオチンなどの官能性基を、S-acylateタンパク質17、18、19,18,19の検出を可能にする集積脂肪酸に付着させるために使用することができる。
アシルビオチン交換(ABE)は、組織サンプル15に不適当な代謝標識の欠点のいくつかをバイパスするS-acylatedタンパク質の捕捉および同定に広く用いられている生化学的方法の1つである。この方法は、組織および凍結細胞試料20,21,21を含む多様な生物学的サンプルにおけるS-アシル化の分析に適用することができる。この方法は、中性ヒドロキシルアミンによるアシル基とシステイン残基との間のチオエステル結合の選択的切断に基づく。遊離チオール基は、次いでチオール反応性ビオチン誘導体で捕捉される。生成されたビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジンアガロースを使用して親和性精製され、免疫ブロッティングによって分析されます。
アシル樹脂アシスト捕捉(Acyl-RAC)と呼ばれた代替アプローチは、後に、シオール反応性樹脂22,23,23による遊離システインの直接結合と共にビオチン化ステップを置き換えるために導入された。この方法は、ABEと比較して少ないステップを有し、同様に、サンプル1の広い範囲でタンパク質S-アシル化を検出するために使用することができる。
Acyl-RACは4つの主要なステップ(図1)で構成されています。
1. 無料チオール群のブロック;
2. システイン-アシルチオエステル結合の選択的切断中性ヒドロキシルアミン (HAM) システインチオール基を露出する;
3. チオール反応性樹脂を用いた脂質化されたシステインの捕獲;
4. 還元バッファーと溶出後の S-acylated タンパク質の選択的濃縮.
次いで、捕捉したタンパク質を免疫ブロッティングにより分析するか、または質量分析(MS)ベースのプロテオミクスを行い、S-acylatedプロテオームを様々な種および組織22、24、2524,25の範囲で評価することができる。22個々のS-アシル化部位は、捕捉されたタンパク質のトリプシン消化およびLC-MS/MS22による得られたペプチドの分析によっても同定することができる。ここでは、細胞株と組織サンプルの両方で、複数のタンパク質のS-アシル化を同時に検出するためにacyl-RACを使用する方法を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで、マウス組織由来の培養ヒト細胞および一次細胞の両方で選択したタンパク質のS-アシル化を検出するために、アシル-RACアッセイを利用することに成功しました。この方法は、単純で敏感であり、標準的な生化学技術を使用して最小限の装置要件で簡単に行うことができます。この方法は、タンパク質転写系のβサブユニット(Sec61b)、リボソームタンパク質S11(Rps11)、およびミクロソー?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所の助成金5R01GM115446と1R01GM130840によって支援されました。
Materials
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets | Sigma | 11836170001 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| Hydroxylamine (HAM) | Sigma | 159417 | |
| Methyl methanethiosulfonate (MMTS) | Sigma | 64306 | |
| Mini tube rotator | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) | Sigma | D641 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
| Ultrasonics Quantrex Sonicator | L & R |
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