아실-레신 보조 포획을 이용한 단백질 S-아실레이션 검출
Summary
아실-RAC(Acyl-Resin Assisted Capture)는 다양한 생물학적 샘플에서 시스테인 잔류물(S-acylation)의 가역적 지질 변형을 검출하는 매우 민감하고 신뢰할 수 있으며 수행하기 쉬운 방법입니다.
Abstract
단백질 S-아실화, 또한 S-팔미토일화라고도, 비질 티오에스터 결합을 통해 긴 사슬 지방산시스테인 잔류물의 가역 적인 번역 후 수정이다. 광범위한 규제 메커니즘으로 부상하고 있는 S-acylation은 복잡한 형성에서 단백질 인신 매매 및 단백질 안정성에 이르기까지 단백질의 생물학적 활성의 거의 모든 측면을 조절할 수 있습니다. 단백질 S-아실화의 생물학적 기능에 대한 이해의 최근 진전은 다양한 생물학적 샘플에서 단백질 S-아실화를 강력하고 민감하게 검출할 수 있도록 하는 새로운 생화학 적 도구의 개발로 인해 크게 달성되었습니다. 여기서, 우리는 아실 수지 보조 포획(Acyl-RAC)을 설명하며, 티올 반응성 세파로즈 비드에 의한 내인성 S-아사이클레이트 단백질의 선택적 포획에 기초한 최근 개발된 방법을 설명합니다. 기존 접근법에 비해 Acyl-RAC는 더 적은 단계가 필요하며 새로운 S-acylation 표적을 식별하기 위한 질량 분석과 결합될 때 보다 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술에 있는 중요한 제한은 동일 thioester 결합을 통해 시스테인에 붙어 있는 지방산 종 사이 구별하는 기능의 부족입니다.
Introduction
S-아실화는 비질 티오에스터 결합1을통해 표적 단백질상에 지방 아실 사슬을 내부 시스테인 잔류물로 첨가하는 가역적 번역 후 변형이다. 그것은 먼저 팔미네이트와 단백질의 수정으로 보고 되었다, 포화 16 탄소 지방산2,따라서이 수정 은 종종 S-팔미토일화라고. 팔미네이트 이외에, 단백질은 다양한 길고 짧은 포화 (myristate 및 stearate), 단일 불포화 (oleate) 및 고도 불포화 (아라키도네이트 및 에이코사펜타노에이트) 지방산3,4,4,5,,6,,7에의해 가역적으로 변형 될 수 있다. 진핵 세포에서, S-아실화는 DHHC 단백질 아실트랜스퍼라제로 알려진 효소의 가족에 의해 촉매되고 시스테인 탈아실화의 역반응은 단백질 티에스테르아제에 의해 촉매화되며,8대부분은 여전히 수수께끼8로 남아 있다.
티오에스터 결합의 lability는 이 지질 변형을 가역적으로 만들어, 동적으로 단백질 군집화, 혈장 막 국소화, 세포내 인신 매매, 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 안정성9,,10. 결과적으로, S-아실레이션은 헌팅턴병, 알츠하이머병 및 여러 유형의 암(전립선, 위, 방광, 폐, 대장암)을 포함하는 여러 장애와 관련이 있으며, 이는 이러한 번역 후 단백질 변형을 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법의 개발이 필요하다11.
방사성 물질([3H],[14C] 또는[125I])을 가진 대사 표지는 S-아실화 단백질 을 분석하기 위해 개발된 첫 번째 접근법 중하나였다(12,,13,,14. 그러나, 방사성 표지 기반 방법은 건강 문제를 제시하고, 매우 민감하지 않고, 시간이 오래 걸리며, 고도로 풍부한 단백질의 지질만검출한다 15. 방사성 표지에 대한 더 빠르고 비방사성 대안은 단백질 S-아실레이션16의역학을 분석하기 위해 일상적으로 사용되는 생체 부착 지방산 프로브로 대사 라벨링입니다. 이 방법에서, 화학 리포터(알킨 또는 아지드기)를 가진 지방산은 단백질 아실트랜스퍼라제에 의해 S-아실화 단백질내로 통합된다. 아지드-알키젠 후이스겐 사이클로첨가반응(click chemistry)은 불소 또는 비오틴과 같은 기능화된 군을 부착하여, S-아실화단백질(17,,18,,19)의검출을 허용하는 통합 지방산에 부착하는데 사용될 수 있다.
아실-비오틴 교환(ABE)은 조직시료에대한 부적합성과 같은 대사 라벨링의 단점 중 일부를 우회하는 S-아실화성 단백질의 포획 및 동정을 위해 광범위하게 사용되는 생화학적 방법 중 하나이다. 이 방법은 조직 및 냉동 세포 시료20,,21을포함하는 다양한 범위의 생물학적 샘플에서 S-아실레이션의 분석을 위해 적용될 수 있다. 이 방법은 중성 하이드록실라민에 의한 아실기와 시스테인 잔기 사이의 티오에스터 결합의 선택적 절단에 기초한다. 해방된 티올 그룹은 티올 반응성 비오틴 유도체로 포획됩니다. 생성된 생체면역단백질은 스트렙타비딘 아가로오스를 사용하여 친화도 정제되고 면역블로팅에 의해 분석된다.
아실-수지 보조 포획(Acyl-RAC)이라는 대안적인 접근법은 나중에 티올-반응성수지(22,,23)에의한 자유 시스테인의 직접적인 접합으로 생체측화 단계를 대체하기 위해 도입되었다. 이 방법은 ABE에 비해 단계가 적고 유사하게 광범위한 샘플1에서단백질 S-아실화를 검출하는데 사용될 수 있다.
아실-RAC는 4개의 주요 단계로 구성되어있습니다(그림 1),
1. 무료 티올 그룹의 차단;
2. 시스테인-아실 티에스터 결합과 중성 하이드록실라민(HAM)의 선택적 절단은 시스테인 티올 기를 노출시키는;
3. 티올 반응성 수지로 지방 시스테인을 포착;
4. 완충제를 줄이면서 용출 후 S-아사이클화 단백질의 선택적 농축.
포획된 단백질은 다양한 범위의 종 및,조직22,,24,25에서S-아실화 프로테오메를 평가하기 위해 면역블롯팅 또는 질량분광법(MS) 기반 프로테오믹스를 실시하여 분석될 수 있다. 개별 적인 S-아실화 부위는 또한 LC-MS/MS22에의한 생성된 펩티드의 포착된 단백질및 분석의 트립신 소화에 의해 확인될 수 있다. 여기에서, 우리는 아실-RAC가 세포주 및 조직 샘플 모두에서 다중 단백질의 S-acylation의 동시 검출을 위해 사용될 수 있는 방법을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서, 우리는 성공적으로 마우스 조직으로부터 유래된 배양된 인간 세포 및 1차 세포 모두에서 선택된 단백질의 S-아실화를 검출하기 위해 아실-RAC 검정을 활용하였다. 이 방법은 간단하고 민감하며 표준 생화학 기술을 사용하여 최소한의 장비 요구 사항으로 쉽게 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 단백질 전탈 시스템(Sec61b), 리보좀 단백질 S11(Rps11), 및 미세소좀 글루타티온-S-트랜스페라제 3(MGST3)?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강 보조금 5R01GM115446 및 1R01GM130840의 국가 학회에 의해 지원되었습니다.
Materials
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets | Sigma | 11836170001 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| Hydroxylamine (HAM) | Sigma | 159417 | |
| Methyl methanethiosulfonate (MMTS) | Sigma | 64306 | |
| Mini tube rotator | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) | Sigma | D641 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
| Ultrasonics Quantrex Sonicator | L & R |
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