Påvisning av protein s-acylasjon ved hjelp av Acyl-harpiks assistert fangst

Summary

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) er en svært følsom, pålitelig og enkel å utføre metode for å oppdage reversibel lipidmodifikasjon av cysteinrester (S-acylation) i en rekke biologiske prøver.

Abstract

Protein S-acylation, også referert til som S-palmitoylering, er en reversibel post-translasjonell modifikasjon av cysteinrester med lange kjedefettsyrer via en labile tioester binding. S-acylation, som fremstår som en utbredt regulatorisk mekanisme, kan modulere nesten alle aspekter av den biologiske aktiviteten til proteiner, fra kompleks dannelse til proteinhandel og proteinstabilitet. Den nylige fremgangen i forståelsen av den biologiske funksjonen til protein S-acylation ble oppnådd i stor grad på grunn av utviklingen av nye biokjemiske verktøy som tillater robust og sensitiv påvisning av protein S-acylation i en rekke biologiske prøver. Her beskriver vi acyl harpiksassistert fangst (Acyl-RAC), en nylig utviklet metode basert på selektiv fangst av endogene S-acylated proteiner av tiol-reaktive sepharose perler. Sammenlignet med eksisterende tilnærminger, acyl-RAC krever færre trinn og kan gi mer pålitelige resultater når kombinert med massespektrometri for identifisering av nye S-acylation mål. En stor begrensning i denne teknikken er mangelen på evne til å diskriminere mellom fettsyrearter knyttet til cystein via samme tioester binding.

Introduction

S-acylation er en reversibel post-translasjonell modifikasjon som involverer tilsetning av en fet acylkjede til en intern cysteinrester på et målprotein via en labile tioester bond¹. Det ble først rapportert som en modifikasjon av proteiner med palmitat, en mettet 16-karbon fettsyre², og derfor er denne endringen ofte referert til som S-palmitoylering. I tillegg til palmitat, proteiner kan være synlig modifisert av en rekke lengre og kortere mettet (myristate og stearat), enumettet (oleate) og flerumettet (arachidonate og eicosapentanoat) fettsyrer^3,4,5,6,7. I eukaryyotiske celler katasieres S-acylasjon av en familie av enzymer kjent som DHHC protein acyltransferases og omvendt reaksjon av cystein deacylering er katalysert av protein tioesterases, hvorav de fleste fortsatt forblir gåtefulle⁸.

Labiliteten til tioesterbindingen gjør denne lipidmodifikasjonen reversibel, slik at den dynamisk kan regulere proteinklynger, plasmamembranlokalisering, intracellulær handel, proteinproteininteraksjoner og proteinstabilitet^9,10. Følgelig har S-acylation vært knyttet til flere lidelser, inkludert Huntington sykdom, Alzheimers sykdom og flere typer kreft (prostata, mage, blære, lunge, kolorektal), som nødvendiggjør utvikling av pålitelige metoder for å oppdage denne post-translasjonelle protein modifikasjon¹¹.

Metabolsk merking med radioaktivt ([³H], [¹⁴C] eller [¹²⁵I]) palmitat var en av de første tilnærmingene utviklet for å analyse protein S-acylation^12,13,14. Radiomerkingsbaserte metoder presenterer imidlertid helsemessige bekymringer, er ikke veldig følsomme, tidkrevende, og oppdager bare lipidering av svært rikelig proteiner¹⁵. Et raskere og ikke-radioaktivt alternativ til radiomerking er metabolsk merking med bioortogonale fettsyresonder, som brukes rutinemessig til å analysedynamikken i protein S-acylation¹⁶. I denne metoden er en fettsyre med en kjemisk reporter (alkyne eller azidegruppe) innlemmet i S-acylated protein av et proteinacyltransferase. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaksjon (klikk kjemi) kan deretter brukes til å feste en funksjonalisert gruppe, for eksempel en fluoroforeller eller biotin, til integrert fettsyre som tillater påvisning av S-acylated protein^17,18,19.

Acyl-biotin utveksling (ABE) er en av de omfattende brukte biokjemiske metoder for fangst og identifisering av S-acylated proteiner som omgår noen av manglene ved metabolsk merking som uegnethet for vevsprøver¹⁵. Denne metoden kan brukes til analyse av S-acylation i et variert utvalg av biologiske prøver, inkludert vev og frosne celleprøver^20,,21. Denne metoden er basert på selektiv spalting av tioesterbindingen mellom acylgruppen og cysteinrester av nøytral hydroksylamin. De frigjorte tiolgruppene fanges deretter opp med et tiol-reaktivt biotinderivat. De genererte biotinylated proteiner blir deretter affinitet-renset ved hjelp av streptavidin agarose og analysert av immunblotting.

En alternativ tilnærming kalt acyl-harpiks assistert fangst (Acyl-RAC) ble senere introdusert for å erstatte biotinylation trinn med direkte bøyning av frie cystein av en tiol-reaktiv harpiks^22,23. Denne metoden har færre trinn sammenlignet med ABE og kan på samme måte brukes til å oppdage protein S-acylation i et bredt spekter av prøver¹.

Acyl-RAC består av 4 hovedtrinn (Figur 1)
1. Blokkering av gratis tiolgrupper;
2. Selektiv spalting av cystein-acyl tioester bånd med nøytral hydroksylamin (HAM) for å avsløre cystein tiol grupper;
3. Fangst av lipiderte cysteinmed en tiol-reaktiv harpiks;
4. Selektiv berikelse av S-acylated proteiner etter elution med reduserende buffer.

De fangede proteinene kan deretter analyseres ved immunblotting eller utsatt for massespektrometri (MS) basert proteomics for å vurdere S-acylated proteome i et variert utvalg av arter og vev^22,24,25. Individuelle S-acylation nettsteder kan også identifiseres ved trypsin fordøyelse n av fanget proteiner og analyse av de resulterende peptider av LC-MS/MS²². Her viser vi hvordan acyl-RAC kan brukes til samtidig påvisning av S-acylation av flere proteiner i både en cellelinje og en vevsprøve.

Protocol

Mus som brukes i denne protokollen ble euthanized i henhold til NIH retningslinjer. Dyrevelferdskomiteen ved University of Texas Health Science Center i Houston godkjente alt dyrearbeid. 1. Utarbeidelse av celle lysates Forbered lysisbufferen som beskrevet i tabell 1. Til 10 ml PBS, tilsett 0,1 g n-dodecyl β-D-maltoside vaskemiddel (DDM) og roter for å oppløse. Tilsett 100 μL fosfatasehemmer cocktail 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) og proteasehemmercocktail (1x) …

Representative Results

Etter protokollen beskrevet ovenfor, vi først brukt acyl-RAC å samtidig oppdage S-acylation av flere proteiner i Jurkat celler, en udødeliggjort T cellelinje opprinnelig avledet fra perifert blod av en T celle leukemi pasient27. Regulatoriske T celle proteiner tidligere identifisert som S-acylated9,28,29 ble valgt for å demonstrere nytten av denne metoden. Som vist i figur 2A,</st…

Discussion

Her brukte vi acyl-RAC-analysen for å oppdage S-acylation av utvalgte proteiner i både kultiverte menneskelige celler og primære celler avledet fra musevev. Denne metoden er enkel, følsom, og kan enkelt utføres med minimale utstyrskrav ved hjelp av standard biokjemiteknikker. Denne metoden har vist seg å identifisere nye S-acylated proteiner som β-subunit av protein translocating system (Sec61b), ribosomal protein S11 (Rps11), og mikrosomal glutation-S-transferase 3 (MGST3)²². Føl…

Materials

cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets	Sigma	11836170001
Eppendorf Centrifuge 5424	Eppendorf	22620444
Hydroxylamine (HAM)	Sigma	159417
Methyl methanethiosulfonate (MMTS)	Sigma	64306
Mini tube rotator	LabForce
ML211	Cayman	17630
Multi-Therm Cool-Heat-Shake	Benchmark Scientific	H5000-HC
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM)	Sigma	D641
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5726
Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)	Sigma	T8387
Ultrasonics Quantrex Sonicator	L & R