सिपन्यूकुलस नुडस कोलोमिक फ्लूइड के लिए सीटू संकरण में
Summary
यह प्रोटोकॉल सिपुकुलस नुडस कॉस्लोमिक द्रव में एमआरएनए अभिव्यक्ति के स्तर और लक्ष्य जीन के स्थानिक पैटर्न का पता लगाने के लिए सीटू संकरण दृष्टिकोण में एक प्रभावी का वर्णन करता है।
Abstract
सीटू संकरण (ईश) में ऊतकों में विशिष्ट जीन (जैसे, एमआरएनए और एनसीआरएनए) के सेलुलर वितरण पैटर्न पेश करने के लिए एक बहुत ही जानकारीपूर्ण तकनीक है। सिपन्यूक्यूलिड वर्म सिपन्यूकुलस न्यूडस एक महत्वपूर्ण मत्स्य संसाधन है क्योंकि इसमें उच्च पोषण और औषधीय मूल्य हैं। वर्तमान में, सिपन्यूकुलस नुडस के आणविक जीव विज्ञान पर शोध अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है। इस लेख का उद्देश्य सिपुंगकुलस नुडस कोलोमिक द्रव में विशिष्ट एमआरएनए को स्थानीयकृत करने के लिए एक संवेदनशील विधि विकसित करना है। प्रोटोकॉल में ईश के विस्तृत कदम शामिल हैं, जिनमें डाइगोक्सीजेनिन-लेबल एंटीसेंस और सेंस राइबोप्रोब तैयारी, कॉस्लोमिक फ्लूइड कलेक्शन और सेक्शन तैयारी, विशिष्ट राइबोप्रोब हाइब्रिडाइजेशन, एंटीबॉडी इनक्यूबेशन, कलरेशन और पोस्ट-कलरेशन उपचार शामिल हैं। इस विधि का उपयोग करके एक सफल प्रयोग से प्राप्त प्रतिनिधि परिणामों का प्रदर्शन किया जाता है। प्रोटोकॉल अन्य सिपकुला प्रजातियों पर भी लागू होना चाहिए।
Introduction
ईश, विशिष्ट डीएनए या ब्याज के आरएनए अनुक्रम का पता लगाने के लिए एक लेबल न्यूक्लिक एसिड जांच का उपयोग करना, रूपात्मक रूप से संरक्षित ऊतकों1,2,2,3में लक्ष्य जीन के स्थानिक अभिव्यक्ति पैटर्न का वर्णन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है। आम तौर पर, लक्ष्य अनुक्रम बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) द्वारा उत्पन्न होता है, और फिर डिगोक्सिजेनिन उरीडीन-5′-त्रिपोस्फेट के साथ लेबल किए गए एंटीसेंस/सेंस आरएनए जांच को संश्लेषित करने के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जाता है। रिबोप्रोजांच के साथ इनक्यूबेशन से पहले नमूने तय और पार्म्यबिल किए जाते हैं । अतिरिक्त जांच को धोने के बाद, संकरण इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा एंटी-डिगऑक्सीजनइन एंटीबॉडी का उपयोग करके कल्पना की जाती है, जो क्षारीय फॉस्फेट-कंजुगेड3,,4,,5,,6है।
सिपन्यूकुलस नुडस (फिलम सिपुंगुला; ऑर्डर सिपुंगकुलाइडा: सिपुंगकुलिडे) एक अखंडित, कोलोमेट और द्विपक्षीय सममित समुद्री कृमि7,,8है । सिपुंगकुलस नुडस एक महानगरीय प्रजाति है जो उष्णकटिबंधीय और शीतोष्ण तटीय जल में व्यापक रूप से वितरित की जाती है। दक्षिणी चीन में यह एक महत्वपूर्ण समुद्री मत्स्य संसाधन भी है क्योंकि इसके उच्च पोषण और औषधीय मूल्य9,10. हालांकि, आणविक जीव विज्ञान में सिपन्यूकुलस नुडस अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है । जीन की जैविक भूमिका को पूरी तरह से समझने के लिए, एक सेलुलर संकल्प पर जीन अभिव्यक्ति पैटर्न की जांच बहुत रुचि है । गैर-मॉडल जीव सिपन्यूकुलस नुडसमें, ईश विधि, जो जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का पता लगाने के लिए एक आदर्श विधि है, अभी तक स्थापित नहीं की गई है। इसके लौकोपिक तरल पदार्थ में कई कोशिका प्रकार होते हैं, जिनमें ग्रैनुलोसाइट्स, कलश कोशिकाएं, वेसिकुलर कोशिकाएं, रोगाणु कोशिकाएं, एरिथ्रोसाइट्स आदिशामिलहैं। इस विधि में प्रतिनिधि जीन के रूप में उपयोग किया जाने वाला डबल सेक्स/एमएबी-3 संबंधित प्रतिलेखन कारक-1(dmrt1),अकशेरुकी से लेकर स्तनधारियों तक की अधिकांश प्रजातियों में लिंग निर्धारण और भेदभाव का एक अत्यधिक संरक्षित प्रतिलेखन नियामक है12,,13। प्रजातियों की एक श्रृंखला में (यानी, काला पोर्गी, आदि) 14, DMrt1 सर्टली कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था, अंकुरित कोशिकाओं के आसपास, जिसका कार्य सिपन्यूकुलस नुडसकी ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं के समान है । इसलिए, हमने परिकल्पना की कि सिपन्यूकुलस नुडस के डीएमआरटी1 को शुक्राणुओं की ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, और ईश विधि के परिणाम ने स्पष्ट रूप से परिकल्पना की पुष्टि की।
पहली बार के लिए इस प्रोटोकॉल ISH का वर्णन करता है, digoxigenin लेबल एंटीसेंस के साथ/भावना mRNA जांच, अपने लौकिक द्रव धब्बा में mRNA अभिव्यक्ति पैटर्न निर्धारित करने के लिए । इष्टतम प्रतिक्रिया शर्तों की आपूर्ति की जाती है, जो उच्च संकल्प पर एमआरएनए अभिव्यक्ति के बहुत संवेदनशील दृश्य की अनुमति देते हैं। विकसित ईश विधि को संभावित रूप से सिपन्यूकुलस नुडस के अलावा अधिक सिपुंगलिडा प्रजातियों में लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ईश कई लक्ष्य आरएनए16,17,,18का पता लगाने के लिए उपयुक्त है । इस प्रोटोकॉल में, हमने कॉस्लोमिक तरल पदार्थ में एमआरएनए का पता लगाने और सिपन्य…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन (ग्रांट नंबर 31801034), फुजियान प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन, चीन (2016J01161), हुआकिओ विश्वविद्यालय के वैज्ञानिक अनुसंधान कोष (15BS306) और हुआकिओ विश्वविद्यालय के वैज्ञानिक अनुसंधान में स्नातकोत्तर अभिनव कोष के युवा वैज्ञानिक कोष द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
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