Meten RAN Peptide Toxiciteit in C. elegans
Summary
Herhaal-geassocieerde niet-ATG-afhankelijke translationele producten zijn opkomende pathogene kenmerken van verschillende herhaalde expansie-gebaseerde ziekten. Het doel van het beschreven protocol is om toxiciteit veroorzaakt door deze peptiden te evalueren met behulp van gedrags-en cellulaire testen in het modelsysteem C. elegans.
Abstract
C. elegans wordt vaak gebruikt voor het modelleren van leeftijdsgebonden neurodegeneratieve ziekten veroorzaakt door herhaalde expansiemutaties, zoals Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) en de ziekte van Huntington. Onlangs werd aangetoond dat herhaald expansiebevattend RNA het substraat is voor een nieuw type eiwitvertaling dat herhaal-geassocieerde niet-AUG-afhankelijke (RAN)-vertaling wordt genoemd. In tegenstelling tot canonieke vertaling vereist RAN-vertaling geen startcodon en treedt alleen op wanneer herhalingen een drempellengte overschrijden. Omdat er geen begincodon is om het leeskader te bepalen, vindt RAN-vertaling plaats in alle leesframes van zowel sense- als antisense RNA-sjablonen die een herhalingsuitbreidingsreeks bevatten. Daarom breidt RAN-vertaling het aantal mogelijke ziektegerelateerde toxische peptiden uit van één naar zes. Tot nu toe is ran vertaling gedocumenteerd in acht verschillende repeat expansion-based neurodegeneratieve en neuromusculaire ziekten. In elk geval is het ontcijferen van welke RAN-producten giftig zijn, evenals hun mechanismen van toxiciteit, een cruciale stap in de richting van inzicht in hoe deze peptiden bijdragen aan de pathofysiologie van de ziekte. In dit artikel presenteren we strategieën om de toxiciteit van RAN peptiden in het modelsysteem C. elegans te meten. Ten eerste beschrijven we procedures voor het meten van RAN peptide toxiciteit op de groei en beweeglijkheid van het ontwikkelen van C. elegans. Ten tweede detaileren we een test voor het meten van postontwikkelings-, leeftijdsafhankelijke effecten van RAN peptiden op beweeglijkheid. Ten slotte beschrijven we een neurotoxiciteitstest voor het evalueren van de effecten van RAN-peptiden op neuron morfologie. Deze tests bieden een brede beoordeling van ran peptide toxiciteit en kan nuttig zijn voor het uitvoeren van grootschalige genetische of kleine molecuul schermen om ziekte mechanismen of therapieën te identificeren.
Introduction
De ongepaste uitbreiding van DNA-herhalingssequenties is de genetische basis voor verschillende neurodegeneratieve ziekten zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS), frontotemporale dementie (FTD) en de ziekte van Huntington (ZvH)1. Hoewel er gevestigde cellulaire en dierlijke modellen voor deze ziekten, mechanismen die ten grondslag liggen aan deze voorwaarden zijn niet goed gedefinieerd. De ZvH wordt bijvoorbeeld veroorzaakt door de uitbreidingen van een CAG herhalingssequentie in de coderingssequentie voor het Huntingtine eiwit Htt2. Omdat CAG codeert het aminozuur glutamine, de CAG herhalen expansie resulteert in het inbrengen van een polyGlutamine, of polyQ, sequentie binnen Htt. Uitgebreide polyQ eiwitten vormen lengte- en leeftijdsafhankelijke eiwitaggregaten die worden geassocieerd met toxiciteit3,4. Verrassend genoeg suggereren twee recente studies dat de lengte van de polyQ-sequentie niet de belangrijkste drijfveer is voor het begin van de ZvH ziekte, wat suggereert dat polyQ-onafhankelijke factoren ook kunnen bijdragen aan de ziekte5,6.
Een mogelijk polyQ-onafhankelijk mechanisme betreft een nieuw ontdekt type eiwitvertaling dat Repeat Associated Non-AUG-dependent (RAN) vertaling7wordt genoemd. Zoals de naam al aangeeft, ran vertaling treedt alleen op wanneer een uitgebreide herhaling sein en vereist geen canonieke start codon. Daarom vindt RAN-vertaling plaats in alle drie de leesframes van de herhaling om drie verschillende polypeptiden te produceren. Bovendien, omdat veel genen ook een antisense transcript produceren dat de omgekeerde aanvulling van de uitgebreide herhalingssequentie bevat, komt RAN-vertaling ook voor in alle drie de leesframes van het antisense transcript. Samen breidt RAN-vertaling het aantal eiwitten uit dat wordt geproduceerd uit een uitgebreide herhalende DNA-sequentie van één peptide naar zes peptiden. Tot op heden is ran-vertaling waargenomen in ten minste acht verschillende herhalingsstoornissen8. RAN peptiden worden waargenomen in postmortem patiënt monsters en alleen in gevallen waarin de patiënt draagt een uitgebreide herhaling9,10. Hoewel deze peptiden duidelijk aanwezig zijn in patiëntencellen, is hun bijdrage aan de pathofysiologie van de ziekte onduidelijk.
Om de potentiële toxiciteit in verband met RAN peptiden beter te definiëren, hebben verschillende groepen elk peptide uitgedrukt in verschillende modelsystemen, zoals gist, vliegen, muizen en weefselkweekcellen11,12,,13,14,15,16. In plaats van gebruik te maken van de herhalingsvolgorde voor expressie, maken deze modellen gebruik van een codon-variatie benadering waarbij de herhalingssequentie wordt geëlimineerd, maar de aminozuursequentie behouden blijft. Vertaling initiatie vindt plaats via een canonieke ATG en het peptide is meestal gesmolten tot een fluorescerend eiwit op ofwel de N- of C-eindpunt, geen van beide lijkt te interfereren met RAN peptide toxiciteit. Daarom drukt elke constructie een enkel RAN-peptide uit. Het modelleren van de verschillende RAN-producten in een meercellig organisme met eenvoudige tests om ran peptide toxiciteit te meten is van vitaal belang om te begrijpen hoe de verschillende RAN-producten van elke ziekte-veroorzakende herhaalde expansie bijdragen aan cellulaire disfunctie en neurodegeneratie.
Net als andere modelsystemen biedt C. elegans een flexibel en efficiënt experimenteel platform dat studies van nieuwe ziektemechanismen mogelijk maakt, zoals RAN peptide toxiciteit. Wormen bieden verschillende unieke experimentele attributen die momenteel niet beschikbaar zijn in andere modellen van RAN peptide toxiciteit. Ten eerste, C. elegans zijn optisch transparant vanaf de geboorte tot de dood. Dit zorgt voor eenvoudige visualisatie van RAN peptide expressie en lokalisatie, evenals in vivo analyse van neurodegeneratie bij levende dieren. Ten tweede, transgene methoden voor het genereren van RAN peptide expressie modellen zijn goedkoop en snel. Gezien de korte driedaagse levenscyclus van C. elegans,kunnen stabiele transgene lijnen die een bepaald RAN-peptide op een celtypespecifieke manier uitdrukken, in minder dan een week worden geproduceerd. Ten derde kunnen eenvoudige fenotypische uitgangen worden gecombineerd met genetische screeningsmethoden, zoals chemische mutagenese of RNAi-screening, om snel genen te identificeren die essentieel zijn voor ran peptidetoxiciteit. Tot slot, de korte levensduur van C. elegans (~ 20 dagen) stelt onderzoekers in staat om te bepalen hoe veroudering, dat is de grootste risicofactor voor de meeste herhalen expansieziekten, ran peptide toxiciteit beïnvloedt. Samen is deze combinatie van experimentele kenmerken ongeëvenaard in elk ander modelsysteem en biedt een krachtig platform voor de studie van RAN peptide toxiciteit.
Hier beschrijven we verschillende tests die gebruik maken van de experimentele voordelen van C. elegans om de toxiciteit van RAN peptiden te meten en om genetische modifiers van deze toxiciteit te identificeren. De codon-gevarieerde ATG-geïnitieerde RAN peptiden zijn gelabeld met GFP en individueel uitgedrukt in ofwel spiercellen onder de myo-3 promotor of in GABAergic motorneuronen onder de unc-47 promotor. Voor expressie in spiercellen is het belangrijk dat giftige RAN peptiden worden gelabeld met groene fluorescerende eiwitten (GFP), of andere fluorescerende eiwit (FP) tag die kan worden gericht met een RNAi voedingsvector. Dit komt omdat giftige RAN peptide expressie meestal blokkeert de groei, waardoor dergelijke stammen niet levensvatbaar. Het gebruik van gfp(RNAi) activeert voorwaardelijk RAN peptide expressie en maakt stam onderhoud, genetische kruisen, enz. Voor tests worden deze dieren verwijderd uit gfp(RNAi),waardoor het RAN peptide en de resulterende fenotypes kunnen worden expressie. Naast de moleculaire strategie voor het ontwerpen van codon-gevarieerde RAN peptide expressie constructies, beschrijven we assays voor het meten van ontwikkelingstoxiciteit (larval beweeglijkheid en groei test), post-ontwikkelingsleeftijd-geassocieerde toxiciteit (verlamming assay), en neuron morfologische gebreken (commissure assay).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier rapporteren we methoden die kunnen worden gebruikt om RAN peptide toxiciteit gemodelleerd in de spier of in de neuronen van C. elegansassay. Terwijl neurodegeneratieve eiwitten een leeftijd begin fenotype bij menselijke patiënten hebben, kunnen ze ook ontwikkelingstoxiciteit vertonen wanneer overuitgedrukt in modelsystemen. Overexpressie heeft aanzienlijke interpretatieve beperkingen, maar het biedt ook een krachtig uitgangspunt voor genetische of farmacologische schermen gericht op het identificeren van g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R21NS107797
Materials
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
| COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
| Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
| HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
| Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
| Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
| LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
| MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
| TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |
References
- Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
- The Huntington’s Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington’s disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Genetic Modifiers of Huntington’s Disease Consortium. Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington’s Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington’s Disease Onset. Cell. 178 (4), 887-900 (2019).
- Wright, G. E. B., et al. Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease. American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).
- Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease. Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).
- Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology. Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).
- Banez-Coronel, M., et al. RAN Translation in Huntington Disease. Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).
- Ash, P. E., et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).
- Kramer, N. J., et al. CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity. Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).
- Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Scientific Reports. 6, 20877 (2016).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
- Boeynaems, S., et al. Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics. Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).
- Lee, K. H., et al. C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles. Cell. 167 (3), 717-788 (2016).
- Hao, Z., et al. Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR. Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).
- Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences. BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Rudich, P., et al. Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans. Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).
- Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).
- Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).
- Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans. PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).
- Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
- Peters, O. M., et al. Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice. Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).
- O’Rourke, J. G., et al. C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD. Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).
- Mizielinska, S., et al. C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).
- Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. 유전학. 191 (3), 1015-1021 (2012).
- Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
