यहां, आणविक स्तर पर आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग करके कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में हीट शॉक रिस्पांस (एचएसआर) के शामिल होने का आकलन करने के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए जाते हैं, सेलुलर स्तर पर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स और ऑर्गेनमल स्तर पर थर्मो रिकवरी।
हीट शॉक रिस्पांस (एचएसआर) साइटोसोलिक प्रोटीन द्वारा प्रेरित एक सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया है जो प्रोटीन फोल्डिंग होगोस्टेसिस, या प्रोटेओस्टेसिस को बहाल करने के लिए कार्य करता है। कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस एचएसआर अनुसंधान के लिए एक अद्वितीय और शक्तिशाली जगह है क्योंकि एचएसआर का मूल्यांकन आणविक, सेलुलर और संगठित स्तर पर किया जा सकता है। इसलिए, आणविक स्तर पर परिवर्तनों को सेलुलर स्तर पर कल्पना की जा सकती है और शरीर विज्ञान पर उनके प्रभावों को संगठय स्तर पर मात्रा में बताया जा सकता है। जबकि एचएसआर को मापने के लिए परख सरल हैं, साहित्य में वर्णित समय, तापमान और पद्धति में भिन्नता अध्ययनों में परिणामों की तुलना करना चुनौतीपूर्ण बनाती है। इसके अलावा, इन मुद्दों को अपने अनुसंधान में एचएसआर विश्लेषण को शामिल करने की मांग किसी के लिए एक बाधा के रूप में कार्य करते हैं । यहां, आरटी-क्यूपीसीआर, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स और एक ऑर्गनाइज्ड थर्मो रिकवरी परख के साथ मजबूत और प्रजनन योग्य तरीके से एचएसआर के प्रडक्शन को मापने के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला प्रस्तुत की जाती है। इसके अतिरिक्त, हम बताते हैं कि एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया थर्मोटोलेंस परख एचएसआर, एचएसएफ-1 के अच्छी तरह से स्थापित मास्टर नियामक पर निर्भर नहीं है, और इसलिए एचएसआर अनुसंधान के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। अंत में, साहित्य में पाए जाने वाले इन परखों में भिन्नता पर चर्चा की जाती है और क्षेत्र में परिणामों को मानकीकृत करने में मदद करने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं का प्रस्ताव किया जाता है, अंततः न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, उम्र बढ़ने और एचएसआर अनुसंधान को सुविधाजनक बनाने के लिए।
हीट शॉक रिस्पांस (एचएसआर) एक सार्वभौमिक सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया है जो तापमान वृद्धि और अन्य प्रोटोटॉक्सिक तनावों के कारण साइटोसोलिक प्रोटीन द्वारा प्रेरित होती है। कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में एचएसआर की सक्रियता से एचपीएसपी-70 और एचएसपी-16.2 जैसे हीट शॉक जीन के ट्रांसक्रिप्शनल अप्रेगुलेशन हो जाते हैं। कई हीट शॉक प्रोटीन (एचएसपी) आणविक चैपरोन के रूप में कार्य करते हैं जो सीधे गलत मोड़ या क्षतिग्रस्त प्रोटीन के साथ बातचीत करके प्रोटीन फोल्डिंग होरोस्टेसिस, या प्रोटेओस्टेसिस को बहाल करते हैं। एचएसआर का मास्टर रेगुलेटर ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर हीट शॉक फैक्टर 1 (एचएसएफ-1) है, जिसकी सक्रियण सुंदर ढंग से कई तंत्र 1 के माध्यम सेनियंत्रितहै ।
एचएसएफ-1 की भूमिका तनाव तक ही सीमित नहीं है। सामान्य विकास और विकास के लिए एचएसएफ-1 की आवश्यकता होती है, क्योंकि एचएसएफ-1 को हटाने से लार्वा गिरफ्तारी2हो जाती है । उम्र बढ़ने और उम्र से संबंधित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के दौरान एचएसएफ-1 भी महत्वपूर्ण है जो प्रोटीन समुच्चय के संचय और प्रोटेओस्टेसिस को बनाए रखने में असमर्थता की विशेषता है। एचएसएफ-1 के नॉकआउट से प्रोटीन समुच्चय और एक छोटी उम्र के संचय का कारण बनता है, जबकि एचएसएफ-1 की अधिकव्यक्तता प्रोटीन एकत्रीकरण को कम करती है और उम्र3, 4,4का विस्तार करती है। इसलिए, आणविक स्तर पर एचएसएफ-1 के विनियमन के संगठित शरीर विज्ञान और रोग के लिए व्यापक निहितार्थ हैं ।
C. Elegans एचएसआर अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव है क्योंकि एचएसआर आणविक,,सेलुलर, और संगठित स्तर4,,5,6पर मापा जा सकता है । इस मॉडल की शक्ति पर प्रकाश डालते हुए, एचएसआर मार्ग को चित्रित करने में महत्वपूर्ण प्रगति, जैसे एचएसआर विनियमन में ऊतक-विशिष्ट अंतर, सी एलिगेंस7,,8 मेंखोजागया है। इसके अलावा, सी एलिगेंस व्यापक रूप से उम्र बढ़ने अनुसंधान के लिए प्रयोग किया जाता है और प्रोटेओस्टेसिस व्यवधान से जुड़े रोगों मॉडलिंग के लिए एक उभरती हुई प्रणाली है।
हालांकि सी एलिगेंस के साथ हीट शॉक प्रयोग जल्दी और प्रजनन योग्य हो सकते हैं, लेकिन शुरुआत से पहले विचार करने के लिए कई सवाल हैं। उदाहरण के लिए, एचएसआर को शामिल करने के लिए किस तापमान का उपयोग किया जाना चाहिए और कीड़े कब तक उजागर होने चाहिए? क्या ड्राई इनक्यूबेटर या वॉटर बाथ का इस्तेमाल करना बेहतर है? किस विकास स्तर का उपयोग किया जाना चाहिए? दुर्भाग्य से, एचएसआर की जांच करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धतियां प्रयोगशाला से प्रयोगशाला तक व्यापक रूप से भिन्न होती हैं, जिससे सर्वोत्तम पद्धतियों का चयन करते समय भ्रम पैदा होता है और पूरे क्षेत्र में परिणामों की तुलना करना मुश्किल हो जाता है।
हम एचएसआर को मापने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स और थर्मो रिकवरी का उपयोग करने के लिए मजबूत और मानकीकृत प्रोटोकॉल पेश करते हैं। जबकि ये तीन दृष्टिकोण पूरक हैं, उनमें से प्रत्येक के अद्वितीय फायदे और नुकसान हैं। उदाहरण के लिए, आरटी-क्यूपीसीआर एचएसआर का सबसे प्रत्यक्ष और मात्रात्मक माप है, और इस परख को आसानी से कई अलग-अलग गर्मी सदमे-अकांक्षित जीन को शामिल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, आरटी-क्यूपीसीआर सबसे महंगा है, तकनीकी रूप से मुश्किल हो सकता है, और विशेष उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स को एचएसआर इंडक्शन में ऊतक-विशिष्ट मतभेदों को मापने का लाभ होता है। हालांकि, उन्हें सही मात्रा में बताना मुश्किल है, केवल एक निश्चित सीमा से ऊपर प्रेरण को माप सकते हैं, और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के उपयोग की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, यहां वर्णित रिपोर्टर उपभेदों को मानक N2 तनाव की तुलना में विकास में देरी हो रही है । हालांकि नए रिपोर्टर एकल कॉपी ट्रांसजीन युक्त उपभेदों उपलब्ध हैं, वे यहां परीक्षण नहीं किया गया है9। तीसरी परख थर्मोरी, ऑर्गनाइज्ड लेवल पर फिजिकली प्रासंगिक रीडआउट देने का फायदा है। हालांकि, यह परख यकीनन सबसे कम संवेदनशील और सबसे अप्रत्यक्ष है । अंत में, हम इन परख में पाए जाने वाले कुछ सामान्य विविधताओं पर चर्चा करते हैं और इस क्षेत्र में अनुसंधान को सुगम बनाने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं का एक सेट प्रस्तावित करते हैं।
साहित्य में एचएसआर को परखने के लिए विभिन्न प्रकार के तापमान, समय और उपकरणों का उपयोग किया गया है, जिसने अनावश्यक चेतावनी शुरू की है और प्रयोगशालाओं के बीच परिणामों की तुलना करने में कठिनाई हुई है। उदाहरण के लिए, 32-37 डिग्री सेल्सियस से कहीं भी तापमान और 15 मिनट से कई घंटे तक के तापमान का उपयोग एचएसआर15को प्रेरित करने के लिए किया गया है। हालांकि, यह बताया गया है कि घातकता सभी चरणों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे और दिन 1 वयस्कों के लिए 1.5 घंटे के रूप में जल्दी होती है15वयस्कों। इसके अलावा, हम बताते हैं कि 35 डिग्री सेल्सियस तक कीड़े के जोखिम से घातकता होती है जो एचएसएफ-1 निर्भर नहीं है, जिससे ये स्थितियां एचएसआर के विश्लेषण के लिए खराब अनुकूल हो जाती हैं। इसके विपरीत, 1 घंटे के लिए 33 डिग्री सेल्सियस का गर्मी का झटका गर्मी सदमे जीन के मजबूत प्रेरण को प्रकाश में लाने के लिए पर्याप्त मजबूत है, फिर भी कृमि व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करने के लिए पर्याप्त हल्के है। दरअसल, 33 डिग्री सेल्सियस के संपर्क में आने के लिए जब तक 6 एच केवल 20% कीड़े असामान्य आंदोलन प्रदर्शित करने का कारण बनता है। इसलिए, हम आरटी-क्यूपीसीआर और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर परख के लिए मानकीकृत स्थिति के रूप में 33 डिग्री सेल्सियस के तापमान और 1 घंटे के समय का उपयोग करने का प्रस्ताव करते हैं।
हाल के प्रयोगों से पता चला है कि एचएसआर प्रयोगों के लिए कीड़े का विकासात्मक मंचन विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । यह हाल ही में दिखाया गया था कि सी एलिगेंस में एचएसआर की अक्रूती में गिरावट आती है (यानी, गिर) द्वारा >50% जब hermaphrodites5अंडे बिछाने शुरू करते हैं । कीड़े सही ढंग से मंचन महत्वपूर्ण है क्योंकि वहां अक्सर उत्परिवर्तन ले जाने उपभेदों में विकास के समय में मतभेद हैं । यदि तापमान-संवेदनशील म्यूटेंट का उपयोग किया जाता है, तो यह परिणामों को भी प्रभावित करेगा यदि वे अपनी प्रजनन आयु से सिंक्रोनाइज्ड नहीं हैं। इसलिए, यह निर्धारित करने के लिए हर तनाव के लिए अंडे बिछाने की शुरुआत को ध्यान से मापने की सिफारिश की जाती है जब पतन होता है। एल 4 मोल्ट के बाद और प्रजनन परिपक्वता की शुरुआत से पहले समय की खिड़की संकीर्ण है; इसलिए, देखभाल की जानी चाहिए ताकि एचएसआर पतन अनजाने में परिणामों में परिवर्तनशीलता का कारण न बन सके।
विकास के समय के अलावा, तापमान में आश्चर्यजनक रूप से छोटे परिवर्तन, 1 डिग्री सेल्सियस के रूप में छोटे, एचएसआर पर पर्याप्त प्रभाव डाल सकते हैं। उदाहरण के लिए, सी एलिगेंस में थर्मोसेंसरी न्यूरॉन्स तापमान परिवर्तन के प्रति संवेदनशील होते हैं जो ± 0.05 डिग्री सेल्सियस16के रूप में छोटे होते हैं। इस प्रकार, थर्मामीटर का उपयोग करना अनिवार्य है जो तापमान को सटीक रूप से माप सकता है। इसलिए, हम तापमान माप के लिए एक अंशांकित डिवाइस के उपयोग का सबसे अच्छा अभ्यास करने का प्रस्ताव करते हैं जो ± 0.1 डिग्री सेल्सियस के भीतर तापमान को मापने के लिए पर्याप्त सटीक है। इसके अलावा, समय भर में तापमान में बदलाव को मापने के लिए डेटा-लॉगिंग कार्यक्षमता के साथ एक थर्मामीटर का उपयोग किया जाना चाहिए। कई इनक्यूबेटर को इनक्यूबेटर के विभिन्न हिस्सों में और समय के साथ 1 डिग्री सेल्सियस से अधिक की थर्मल विविधताओं के लिए निर्दिष्ट किया जाता है, जिसका एचएसआर प्रयोगों पर महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है। एक सर्वोत्तम अभ्यास के रूप में, हम उन इनक्यूबेटर का उपयोग करने का सुझाव देते हैं जिनमें तापमान में उतार-चढ़ाव को कम करने के लिए पर्याप्त इन्सुलेशन और परिसंचरण होता है। गर्मी सदमे प्रयोगों के संचालन के लिए, हम एक परिसंचारी पानी स्नान का एक सबसे अच्छा अभ्यास का प्रस्ताव है । आगर की थाली में वांछित तापमान तक पहुंचने में लगने वाला समय पानी के स्नान में लगभग 6-7 मिनट होता है लेकिन सूखे इनक्यूबेटर15,17में बहुत अधिक समय होता है । हालांकि, यदि परिसंचारी जल स्नान उपलब्ध नहीं है, तो हमने दिखाया है कि हमारी स्थितियों का उपयोग करके सूखे इनक्यूबेटर में मजबूत एचएसआर प्रेरण भी होता है। यदि एक सूखे इनक्यूबेटर का उपयोग किया जाता है, तो तनाव की अवधि के लिए इनक्यूबेटर खोलने को कम किया जाना चाहिए।
यह सर्वविदित है कि हीट शॉक जीन को शामिल करना एचएसआर, एचएसएफ-1 के मास्टर रेगुलेटर पर निर्भर करता है । यहां, हम सबूत पेश करते हैं कि दो और अप्रत्यक्ष परख, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स और थर्मो रिकवरी भी एचएसएफ-1 पर निर्भर हैं । गौरतलब है कि हमने पाया कि आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला वैकल्पिक ऑर्गेनमल परख थर्मोटॉलेंस, एचएसएफ-1 आरएनएआई(चित्रा 4)का उपयोग करके एचएसएफ-1 निर्भर नहीं है। इसी तरह के परिणाम पहले एक hsf-1 उत्परिवर्ती या एक ttx-3 ,उत्परिवर्ती, जो एचएसआर18, 19,,1920ब्लॉक का उपयोग कर सूचित किया गया है । साथ में, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि थर्मोटोलेंस परख एचएसआर अनुसंधान के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। इसके अलावा, यह पता चलता है कि एक सबसे अच्छा अभ्यास एचएसआर को मापने के लिए इस्तेमाल किसी भी परख के लिए HSF-1 निर्भरता का परीक्षण करने के लिए है ।
एक साथ लिया, हम सी एलिगेंस में एचएसआर प्रेरण के मजबूत और प्रजनन योग्य माप के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल और सर्वोत्तम प्रथाओं की एक श्रृंखला प्रस्तुत करते हैं। हमें उम्मीद है कि इन पद्धतियों से एचएसआर प्रयोगों में परिवर्तनशीलता में कमी आएगी और प्रजनन क्षमता बढ़ेगी । प्रयोगशालाओं के बीच एचएसआर अनुसंधान की सीधी तुलना को सुविधाजनक बनाना एचएसआर क्षेत्र में अनुसंधान में तेजी लाने का काम करेगा । इसके अलावा, मानकीकरण से अनुसंधान को उम्र बढ़ने और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में लाभ होगा जिनके साथ एचएसआर घनिष्ठ रूप से जुड़ा हुआ है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को फ्रैंक लेस्ली के एक दान ने समर्थन दिया था। सीजीसी द्वारा कुछ उपभेद प्रदान किए गए थे, जिन्हें एनआईएच कार्यालय ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम्स (P40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।
18S-forward primer | TTGCGTCAACTGTGGTCGTG | ||
18S-reverse primer | CCAACAAAAAGAACCGAAGT CCTG |
||
AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))] | Morimoto lab | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/ | |
C12C8.1-forward primer | GTACTACGTACTCATGTGTCG GTATTT |
||
C12C8.1-reverse primer | ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC | ||
CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio Rad | 1855200 | |
CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD | Lascar | EL-USB-TP-LCD | |
Greenough Stereo Microscope S9i Series | Leica | ||
Hard Shell 96 Well PCR Plates | Bio Rad | HSS9601 | |
hsp-16.2-forward primer | ACTTTACCACTATTTCCGTCC AGC |
||
hsp-16.2-reverse primer | CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG | ||
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio Rad | 1708891 | |
iTaq Universal Sybr Green Super Mix | Bio Rad | 1725121 | |
Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | Eclipse 90i | |
MultiGene OptiMax Thermo Cycler | Labnet | TC9610 | |
N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE | |
Parafilm M Roll | Bemis | 5259-04LC | |
RapidOut DNA Removal Kit | Thermo Scientific | K2981 | |
Recirculating Heated Water Bath | Lauda Brinkmann | RE-206 | |
Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer | Fisher Scientific | 15-081-103 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation reagent |
TurboMix Attachment | Scientific Industries | SI-0564 | |
Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 |