植物组织细胞壁中阿拉比诺格拉坦蛋白和皮克廷的荧光免疫化
Summary
该协议详细描述了用于阿拉伯甘草蛋白和果胶免疫的植物材料是如何固定的，嵌入亲水丙烯酸树脂中，在玻璃滑梯上分节并安装。我们显示细胞壁相关的表位将被检测到与特定的抗体。
Abstract
植物发育需要根据内部和外部的刺激不断调整细胞壁的组成和结构。细胞壁由纤维素和非纤维素多糖以及蛋白质、酚类化合物和水组成。90%的细胞壁由多糖（例如皮茨坦）和阿拉伯甘草蛋白（AGPs）组成。植物组织学部分特定甘草表位的荧光免疫化仍然是揭示墙体多糖网络、结构和组件改造的关键工具。
在这里，我们报告一个优化的荧光免疫化程序，以检测来自AGP和植物组织中的皮瓣的甘油表位。与植物样品的LR-White嵌入一起使用甲醛/谷胱甘肽固定，从而更好地保存组织结构和组成。用超微切除术获得的嵌入式样品的细小部分用于特定抗体的免疫化。该技术提供高分辨率、高特异性以及检测同一样本中多个甘油表位的机会。该技术允许甘油的亚细胞定位，并检测其在细胞壁中的积累水平。它还允许在开发过程中确定AGP和果胶分布的空间-时间模式。使用此工具最终可能指导研究方向，并将甘草与植物中的特定功能联系起来。此外，获得的信息可以补充生化和基因表达研究。
Introduction
植物细胞壁是由多糖和糖蛋白组成的复杂结构。细胞壁是极具活力的结构，其结构、组织和组成因细胞类型、定位、发育阶段、外部和内部刺激1而异。阿拉比诺格拉坦蛋白（AGPs）和皮丁是植物细胞壁的重要组成部分。AGP是高糖化蛋白，果胶是同源多糖，其组成、数量和结构在不同的植物发育阶段2、3、4差异很大。AGP和果胶研究表明，他们参与了几个植物过程，如编程细胞死亡，对副生压力的反应，性植物繁殖，等等5。这些研究大多从免疫化研究获得的信息开始。
鉴于其复杂性，研究细胞壁需要许多不同的工具。使用单克隆抗体 （mAbs） 检测甘草表位是解决聚糖和糖蛋白沿此结构分布的宝贵方法。有大量的mAb可用于检测甘油表位和每个mAb的特异性正在不断改善，以及6。此处描述的技术适用于所有植物物种，是指导未来研究方向的完美工具，可能涉及更昂贵和复杂的技术。
在这项技术中，特定的抗体在化学上与荧光染料结合，如FITC（荧光异硫氰酸酯）、TRITC（四甲基多胺-5-（和6）异硫氰酸酯）或几种亚历克萨氟酸盐染料。免疫荧光提供了几个优点，允许在荧光显微镜下直接观察到的甘精的清晰和快速的亚细胞定位。它是高度具体和敏感的，因为样品的制备可以有效地保护抗原的自然结构，即使存在于较低的量。它允许检测多个抗原在同一样本中，最重要的是，提供高质量和视觉上美丽的结果。尽管荧光免疫研究提供了巨大的力量，但它们往往被认为难以执行和实施，很可能是因为缺乏允许可视化程序不同步骤的详细方案。在这里，我们提供了一些简单的指南，如何执行这项技术，以及如何获得高质量的图像。
对于此处提交的协议，样品必须首先使用最合适的固定剂进行固定和嵌入。虽然被认为是一种耗时且相对繁琐的技术，但植物样本的正确固定和嵌入是确保免疫化检测成功的关键。为此，最常见的是使用交叉链接固定剂（如醛）进行化学固定。交叉连接固定剂在组织分子之间建立化学键，稳定和硬化样品。甲醛和谷胱甘肽是交叉连接固定剂，有时两种固定剂的混合物使用7。甲醛为组织提供了很好的结构保存和长时间的保存，产生小组织缩水，并与免疫污染相容。谷胱甘肽是一种更强、更稳定的固定剂，通常与甲醛结合使用。谷胱甘肽的使用有一些缺点，必须考虑到，因为它引入一些自由醛组到固定组织，这可能会产生一些不具体的标签。此外，蛋白质和其他分子之间的交叉连接偶尔可能会使一些目标表位无法接触到抗体。为了避免这种情况，必须仔细定义固定的数量和持续时间。
固定后，样品嵌入适当的树脂中，在获得部分之前变硬。伦敦树脂（LR-White）丙烯酸树脂是免疫化研究的首选树脂。与其他树脂不同，LR-White是亲水的，允许抗体达到其抗原，无需任何治疗，以促进它。LR-White 还具有提供低自动荧光的优势，允许在免疫荧光成像过程中降低背景噪音。
有许多染色技术可用于检测细胞壁的不同成分，如阿尔西亚蓝色染色，甲丁蓝色染色或周期性酸-希夫（PAS）染色。这些都没有提供免疫分析的力量8。这种方法在糖的检测方面具有更大的特异性，提供了关于细胞壁组成和结构的更广泛的信息。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的植物荧光免疫化方法虽然无缝简单，但依赖于几个小步骤的成功。第一个是样品准备和固定。在第一步中，甲醛和谷胱甘肽的混合物用于交叉连接大多数细胞组件。溶液中的甲醛提供温和和可逆的固定，而谷胱甘肽提供更强的永久联系：两个固定剂之间的平衡提供了适当的交叉链接量，允许暴露的表位与主要抗体10反应。要使固定解决方案正常工作，样本必须很小。?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者得到了由H2020-MSCA-RISE-2015和种子轮FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017资助的欧盟项目690946″性种子”（性植物繁殖-种子形成）的支持。AMP获得了欧盟MSCA-IF-2016项目（第753328号）的赠款。MC 获得了 FCT 博士资助 SFRH/BD/111781/2015 的资助。
Materials
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Ethanol absolute | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size sould feat the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| vaccum chamber | na | na | |
| vaccum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
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