Het meten van real-time drug respons in organotypic Tumor Tissue Slices
Summary
We introduceren een protocol voor het meten van real-time reactie van geneesmiddelen in organotypic tumorweefsel plakjes. De hier geschetste experimentele strategie biedt een platform voor het uitvoeren van medium-high throughput drug schermen op weefselsegmenten afgeleid van klinische of muistumoren in ex vivo omstandigheden.
Abstract
Tumorweefsels zijn samengesteld uit kankercellen, geïnfiltreerd immuuncellen, endotheelcellen, fibroblasten, en extracellulaire matrix. Dit complexe milieu vormt de tumormicroomgeving (TME) en kan de respons op therapie in vivo of medicamenteuze respons ex vivo moduleren. Conventionele kanker drug ontdekking schermen worden uitgevoerd op cellen gekweekt in een monolayer, een systeem kritisch ontbreekt de invloed van TME. Zo zullen experimentele systemen die gevoelige en hoge doorvoertesten integreren met fysiologische TME het preklinische medicijndetectieproces versterken. Hier introduceren we ex vivo tumorweefselslicecultuur als platform voor screening van middelhoge doorvoervan geneesmiddelen. Organotypic weefsel slice cultuur vormt precies gesneden, dunne tumor secties die worden gehandhaafd met de steun van een poreus membraan in een vloeibare lucht interface. In dit protocol beschrijven we de voorbereiding en het onderhoud van weefselsegmenten bereid uit muistumoren en tumoren van patiënt-afgeleide xenograft (PDX) modellen. Om veranderingen in de levensvatbaarheid van het weefsel te beoordelen in reactie op de behandeling van geneesmiddelen, maakten we gebruik van een biocompatibele op luminescentie gebaseerde levensvatbaarheidstest die real-time, snelle en gevoelige meting van levensvatbare cellen in het weefsel mogelijk maakt. Met behulp van dit platform evalueerden we dosisafhankelijke reacties van weefselschijfjes op de multi-kinase-remmer, staurosporine en cytotoxische agent doxorubicine. Verder tonen we de toepassing van weefselsegmenten voor ex vivo farmacologie aan door 17 klinische en preklinische geneesmiddelen te screenen op weefselsegmenten bereid uit één PDX-tumor. Ons fysiologisch relevante, zeer gevoelige en robuuste ex vivo screeningplatform zal de ontdekking en besluitvorming van preklinische oncologiegeneesmiddelen sterk versterken.
Introduction
Kankercelinteracties met de fysische en biochemische eigenschappen van het omringende stromale weefsel vormen de TME. TME kan tumorgroei stimuleren, metastase, en moduleren tumor reactie op therapie1. In conventionele preklinische geneesmiddelen ontwikkeling, kandidaat-geneesmiddelen worden meestal eerst gescreend met behulp van gekweekte kanker cellijnen, een test platform dat kritisch ontbreekt de TME2. Dit gebrek aan fysiologische TME in celgebaseerde prescreeningstadia kan de ontdekking van effectieve middelen in tumordragende diermodellen beperken en kan bijdragen aan het hoge uitputtingspercentage van veel veelbelovende oncologische geneesmiddelen in latere klinische stadia van ontwikkeling3.
Ondanks het belang van TME bij het moduleren van tumormedicijnreacties, beperken experimentele beperkingen de toepassing van meer fysiologisch relevante systemen in de vroege stadia van de ontdekking en ontwikkeling van geneesmiddelen. Het is onpraktisch om honderden therapeutische middelen te screenen op tumoren van diermodellen of tumormonsters van patiënten. Chirurgische specimens zijn immers schaarse middelen met uiteenlopende genetische achtergronden en het screenen van duizenden kandidaat-moleculen in diermodellen is niet haalbaar vanwege experimentele schaal, kosten en dierenwelzijn.
Tumorweefsel slice cultuur, waar precies gesneden, dunne tumor secties worden gekweekt ex vivo, kan de beperking van fysiologische TME in drug screening testen aan te pakken. Historisch, het gebied van de neurowetenschappen pionier en maakte uitgebreide optimalisaties van slice cultuur voor hersenweefsel4. Onlangs hebben veel studies aangetoond voorbereiding van plakjes uit verschillende soorten tumorweefsel, waaronder cellijn-afgeleide tumoren, spontane tumormodellen, patiënt-afgeleide xenografts (PDX), en primaire patiënt tumoren. Ex vivo tissue slice cultuur integreert voordelen van zowel in vivo als in vitro cultuur5. Tumorweefselsegmenten behouden intacte weefselarchitectuur en bonte celsamenstelling, waardoor kankercellen binnen de TME-context kunnen worden bestudeerd.
Dit protocol introduceert een organotypic tumor weefsel slice cultuursysteem gecombineerd met een real-time, zeer gevoelige levensvatbaarheid test om de reacties van geneesmiddelen te evalueren. De werkzaamheidstests van de drug op organotypic tumorweefselplakken in eerder geïntroduceerde protocollen zijn gebaseerd op het meten van veranderingen in de levensvatbaarheid van de cel door fluorescerende kleurstofopname, immunohistochemie (IHC) of MTT ((3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 difenyltetrazoliumbromide) test6,7,8,9. Al deze methoden zijn echter eindpunttesten en hebben last van lage gevoeligheid, lange verwerkingstijd, complexe gegevensanalyses, een smal signaalbereik en een hoge experimentele fout. Onze luminescentie-gebaseerde live cel-compatibele reagens verbetert deze tests door het verstrekken van een breed signaal bereik en momentane (~ 5 min) meting zonder voorafgaande verwerking en minimale nabewerking. Dit reagens is zeer gevoelig en kan naast elkaar bestaan in de celcultuur media, waardoor continue en tijd-cursus meting van de levensvatbaarheid van de cel. Dit testsysteem is van toepassing op screening met hoge doorvoer van kandidaat-geneesmiddelen op weefselsegmenten in de ontwikkeling van preklinische geneesmiddelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol tonen we een platform voor kwantitatieve en real-time onderzoek naar de werkzaamheid van geneesmiddelen op organotypic tumorweefselsegmenten. Het weefsel slice cultuursysteem biedt duidelijke voordelen ten opzichte van de traditionele cel-gebaseerde in vitro methoden door het vastleggen van cel heterogeniteit en fysiologische kenmerken van de inheemse tumor micro-omgeving. Dit platform maakt ook een hogere doorvoer mogelijk voor medicijnwerkzaamheidstests, waardoor de kloof tussen celkweekstudies en in vi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] en Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). We willen Dr. Alana Welm (Universiteit van Utah) bedanken voor het verstrekken van de borstkanker PDX tumor. We willen ook het personeel van Comparative Medicine, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) bedanken voor het onderhoud van het PDX-model en leden van het Gujral-lab voor nuttige discussies. N.N.A. wordt ondersteund door de JSPS Overseas Research Fellowship en Interdisciplinary Training Grant van FHCRC. A.J.B. wordt ondersteund door de Chromosoom Metabolisme en Kanker Training Grant van FHCRC.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
- Klemm, F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. Failures in Phase III: Causes and Consequences. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. 신경과학. 305, 86-98 (2015).
- Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment. Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).
- van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86 (2006).
- Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. Journal of Visualized Experiments. (141), e58569 (2018).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. BMC Cancer. 16, 78 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sivakumar, R., et al. Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery. Oncoimmunology. 8 (12), 1670019 (2019).
- Duellman, S. J., et al. Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Lazaro, C. A., et al. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).
- Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2015).
- Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2017).
