Mesurer la réponse en temps réel des médicaments dans les tranches de tissu tumoral organotypique
Summary
Nous introduisons un protocole pour mesurer la réponse de drogue en temps réel dans les tranches organotypic de tissu de tumeur. La stratégie expérimentale décrite ici fournit une plate-forme pour effectuer des écrans de drogue à débit moyen-élevé sur des tranches de tissu dérivées des tumeurs cliniques ou de souris dans des conditions ex vivo.
Abstract
Les tissus tumoraux sont composés de cellules cancéreuses, de cellules immunitaires infiltrées, de cellules endothéliales, de fibroblastes et de matrice extracellulaire. Ce milieu complexe constitue le microenvironnement de tumeur (TME) et peut moduler la réponse à la thérapie in vivo ou réponse de drogue ex vivo. Des écrans conventionnels de découverte de médicaments contre le cancer sont effectués sur des cellules cultivées dans un monolayer, un système qui manque cruellement de l’influence du TME. Ainsi, les systèmes expérimentaux qui intègrent des essais sensibles et à haut débit avec le TME physiologique renforceront le processus préclinique de découverte de médicaments. Here, we introduce ex vivo tumor tissue slice culture as a platform for medium-high-throughput drug screening. La culture organotypic de tranche de tissu constitue précisément-coupée, les sections minces de tumeur qui sont maintenues avec le soutien d’une membrane poreuse dans une interface liquide-air. Dans ce protocole, nous décrivons la préparation et l’entretien des tranches de tissu préparées à partir des tumeurs et des tumeurs de souris des modèles de xénogreffe patient-dérivés (PDX). Pour évaluer les changements dans la viabilité des tissus en réponse au traitement médicamenteux, nous avons mis à profit un essai biocompatible de viabilité à base de luminescence qui permet une mesure en temps réel, rapide et sensible des cellules viables dans le tissu. À l’aide de cette plate-forme, nous avons évalué les réponses dose-dépendantes des tranches de tissu à l’inhibiteur multi-kinase, staurosporine, et agent cytotoxique, doxorubicine. En outre, nous démontrons l’application des tranches de tissu pour la pharmacologie ex vivo en criblage 17 drogues cliniques et précliniques sur des tranches de tissu préparées à partir d’une tumeur simple de PDX. Notre plate-forme de dépistage ex vivo physiologiquement pertinente, hautement sensible et robuste renforcera considérablement la découverte et la prise de décisions en onclinical en oncologie.
Introduction
Les interactions des cellules cancéreuses avec les propriétés physiques et biochimiques du tissu stromal environnant forment le TME. TME peut stimuler la croissance de tumeur, la métastase, et moduler la réponse de tumeur à la thérapie1. Dans le développement de médicaments précliniques conventionnels, les candidats médicamenteux sont généralement d’abord examinés à l’aide de lignées de cellules cancéreuses cultivées, une plate-forme d’essai qui manque de façon critique le TME2. Ce manque de TME physiologique dans les stades de présélection à base de cellules peut limiter la découverte d’agents efficaces dans les modèles animaux porteurs de tumeurs et peut contribuer au taux élevé d’attrition de nombreux médicaments prometteurs en oncologie dans les derniers stades cliniques de développement3.
Malgré l’importance du TME dans la modulation des réponses de médicaments tumoraux, les contraintes expérimentales limitent l’application de systèmes plus physiologiquement pertinents pendant les premiers stades de la découverte et du développement de médicaments. Il n’est pas pratique de dépister des centaines d’agents thérapeutiques sur les tumeurs à partir de modèles animaux ou de spécimens de tumeurs patientes. En effet, les spécimens chirurgicaux sont des ressources limitées avec des antécédents génétiques variés et le dépistage de milliers de molécules candidates dans des modèles animaux n’est pas faisable en raison de l’échelle expérimentale, le coût et le bien-être animal.
La culture de tranche de tissu de tumeur, où précisément couper, les sections minces de tumeur sont ex vivo cultivées, peuvent aborder la limitation du TME physiologique dans les essais de dépistage de drogue. Historiquement, le domaine des neurosciences a été lancé et a fait des optimisations étendues de la culture des tranches pour les tissus cérébraux4. Récemment, beaucoup d’études ont démontré la préparation des tranches de divers types de tissu de tumeur comprenant des tumeurs de lignée-dérivée de cellules, des modèles spontanés de tumeur, des xénogreffes patient-dérivées (PDX), et des tumeurs patientes primaires. La culture des tranches de tissu ex vivo intègre les avantages de la culture in vivo et in vitro5. Les tranches de tissu tumoral conservent l’architecture intacte de tissu et la composition de cellules panacées, permettant l’étude des cellules cancéreuses dans le contexte de TME.
Ce protocole introduit un système organotypic de culture de tranche de tissu de tumeur combiné avec un essai de viabilité en temps réel, fortement sensible pour évaluer des réponses de drogue. Les tests d’efficacité des médicaments sur les tranches de tissu tumoral organotypiques dans les protocoles précédemment introduits reposent sur la mesure des changements dans la viabilité cellulaire par l’incorporation fluorescente de teinture, l’immunohistochemistry (IHC), ou MTT ((3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 diphenyl tetrazolium bromide) ass6,7,8,9. Cependant, toutes ces méthodes sont des essais de point final et souffrent d’une faible sensibilité, d’un long temps de traitement, d’analyses de données complexes, d’une plage de signaux étroite et d’erreurs expérimentales élevées. Notre réactif compatible avec les cellules vivantes à base de luminescence améliore ces essais en fournissant une large gamme de signaux et une mesure instantanée (5 min) sans traitement préalable et un traitement post minimal. Ce réactif est très sensible et peut coexister dans les médias de culture cellulaire, permettant une mesure continue et temporelle de la viabilité cellulaire. Ce système d’essai s’applique au dépistage à haut débit des candidats aux médicaments sur les tranches de tissus dans le développement de médicaments précliniques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous démontrons une plate-forme pour des études quantitatives, et en temps réel d’efficacité de drogue sur des tranches organotypic de tissu de tumeur. Le système de culture de tranche de tissu fournit des avantages distincts au-dessus des méthodes in vitro cellulaires traditionnelles en capturant l’hétérogénéité de cellules et les caractéristiques physiologiques du microenvironnement indigène de tumeur. Cette plate-forme permet également un débit plus élevé pour les tests d’effi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] et Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). Nous tenons à remercier la Dre Alana Welm (Université de l’Utah) d’avoir fourni la tumeur PDX du cancer du sein. Nous tenons également à remercier le personnel de la médecine comparée, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) pour l’entretien du modèle PDX et les membres du laboratoire Gujral pour des discussions utiles. N.N.A est appuyée par la JSPS Overseas Research Fellowship and Interdisciplinary Training Grant du FHCRC. A.J.B. est soutenu par la subvention de formation sur le métabolisme des chromosomes et le cancer du FHCRC.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
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