In Vitro-modell av humant kutan hypertrofisk ärrbildning med makromolekylär trängsel
Summary
Detta protokoll beskriver användningen av makromolekylära trängsel för att skapa en in vitro mänskliga hypertrofisk ärr vävnad modell som liknar in vivo villkor. När odlas i en fullsatt makromolekylär miljö, mänskliga huden fibroblaster uppvisar fenotyper, biokemi, fysiologi och funktionella egenskaper som liknar ärrvävnad.
Abstract
Det har visat sig att in vivo vävnader är mycket trångt av proteiner, nukleinsyror, ribonukleoproteiner, polysackarider, etc. Följande protokoll tillämpar en makromolekylär trängsel (MMC) teknik för att efterlikna denna fysiologiska trängsel genom tillägg av neutrala polymerer (crowders) till cellkulturer in vitro. Tidigare studier med Ficoll eller dextran som crowders visar att uttrycket av kollagen I och fibronectin i WI38 och WS-1 cellinjer förbättras avsevärt med hjälp av MMC-tekniken. Denna teknik har dock inte validerats i primära hypertrofisk ärr-härledda mänskliga huden fibroblaster (hHSFs). Som hypertrofisk ärrbildning uppstår från överdriven nedfall av kollagen, syftar detta protokoll till att konstruera en kollagen-rik in vitro hypertrofisk ärr modell genom att tillämpa MMC tekniken med hHSFs. Denna optimerade MMC-modell har visat sig ha fler likheter med in vivo ärrvävnad jämfört med traditionella 2-dimensionella (2D) cellodlingssystem. Dessutom är det kostnadseffektivt, tidseffektivt och etiskt önskvärt jämfört med djurmodeller. Därför erbjuder den optimerade modellen som rapporteras här en avancerad “in vivo-liknande” modell för hypertrofisk ärrrelaterade studier.
Introduction
Ärrvävnad representerar slutpunkten för vävnadsreparation. Men hos många individer, särskilt de som lider av brännskador eller trauma1, ärrbildning kan vara överdriven och införa oönskade effekter på morfologi och funktion av läkt hud. Även om de exakta mekanismerna för patologiska (hypertrofiska ärr och keloider) ärrbildning inte är helt klarlagda, har överdriven nedfall av kollagen under sårläkning visat sig vara ett viktigt bidrag2.
Det är väletablerat att transformera tillväxtfaktor beta 1 (TGF-β1) och alfa glatt muskulatur aktin (αSMA) spelar nyckelroller i bildandet av hypertrofiska ärr. Bevis tyder på att förhöjd TGF-β1 direkt stimulerar överdriven nedfall av kollagen via reglering av SMAD signalering väg3. Dessutom har αSMA visat sig bidra till hypertrofisk ärrbildning genom att reglera cellkontraktion och reepithelialization i sårläkningsprocessen4. Bristen på lämpliga in vitro- och in vivo-modeller är ett stort hinder för att utveckla och utvärdera interventioner och terapier för ärrsanering. Syftet med denna studie är att utnyttja den befintliga MMC-tekniken för att konstruera en “in vivo-liknande” hypertrofisk ärrmodell som är lämplig för att utvärdera nya och framväxande ärrrelaterade interventioner.
Reproducera levande vävnad utanför kroppen har varit ett mål i flera år i det vetenskapliga samfundet. Utvecklingen av in vitro-tekniker i början av nittonhundratalet delvis uppnått detta mål. Nuvarande in vitro-tekniker har utvecklats något från Roux ursprungliga demonstration att embryonala celler kan överleva ex vivo i flera dagar i varm saltlösning5. In vitro-metoder är dock oftast begränsade till encelliga typer som odlas i 2D och inte korrekt rekapitulerar vävnader in vivo. Även användbart för att undersöka cell biokemi, fysiologi och genetik, inhemska vävnader är 3-D och införliva flera celltyper. Enkla 2D in vitro-system utsätter däggdjursceller för mycket artificiella miljöer där infödd vävnadsspecifik arkitektur går förlorad6. Detta påverkar i sin tur intracellulära och extracellulära händelser, vilket resulterar i onormal cellmorfologi, fysiologi och beteende7.
Intresset bakom detta protokoll ligger i utveckling och klinisk förvaltning av hypertrofisk ärr och keloider. Även om det är väletablerat att dermala fibroblaster är till stor del ansvarig för den rikliga produktionen av kollagen som finns i ärrvävnad, odla dermal fibroblaster med hjälp av 2-D in vitro-system misslyckas med att reproducera omsättningen av kollagen observeras in vivo8. Samtida in vitro-metoder fortfarande i huvudsak använder “varm saltlösning”, en miljö helt annorlunda än i levande vävnader. Vävnader in vivo är extremt trångt, med proteiner, nukleinsyror, ribonukleoproteiner och polysackarider, upptar 5%-40% av den totala volymen. Eftersom inga två molekyler kan uppta samma utrymme samtidigt, det finns lite ledigt utrymme och en nästan fullständig avsaknad av fritt vatten9.
MMC-tekniken medför begränsningar som påverkar cytosolens och interstitella vätskors termodynamiska egenskaper. Molekylära interaktioner, receptor-ligand signalering komplex, enzymer och organeller är begränsade och begränsas från att interagera fritt9. Interaktioner inom den pericellulära miljön (dvs. interstitium) är också begränsade. Nya rön bekräftar att höga koncentrationer av inert makromolekyler i trånga lösningar störande diffusion, fysisk associering, viskositet och hydrodynamiska egenskaper10.
Intressant nog är flera populära trängselmedel (dvs. Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidon [PVP] och natrium 4-styret [PSS]) inte likvärdiga när de tillämpas på olika celltyper och i olika inställningar. I en tidigare studie, Ficoll rapporterades vara mindre cytotoxiska för mesenkymala stamceller jämfört med PVP. Dessa resultat tolkades som en följd av dess neutrala laddning och relativt liten hydrodynamisk radie11. Däremot fann en andra studie att dextran är mer effektivt för att stimulera kollagen jag nedfall av mänskliga lungfibroblaster jämfört med Ficoll12. Data från vår egen studie tyder på att Ficoll förbättrar kollagen nedfall av hypertrofisk ärr-härledda fibroblaster, medan PVP är giftigt för dessa celler13.
Det har visat sig att omvandlingen av procollagen till kollagen är snabbare i en mycket trångt in vivo miljö14, medan graden av biologiska reaktioner försenas i en utspädd 2D kultur system15. Vi har optimerat in vitro-protokollet här, som innehåller MMC för att visa odling av dermala fibroblaster som fungerar som en mer “in vivo-liknande” modell för dermal fibros och ärrbildning. I motsats till den gemensamma 2D-odlingssystem, odla hHSFs med MMC stimulerar biosyntesen och nedfall av kollagen betydligt13. Särskilt andra egenskaper hos fibros (dvs. ökat uttryck för matrismetalloproteinaser [MMPs] och proinflammatoriska cytokiner) är också uppenbara enligt detta optimerade MMC-protokoll13. När odlas med denna metod, det visas att dermal celler rekapitulera fysiologiska, biokemiska och funktionella parametrar mätt in vivo.
Den optimerade MMC in vitro-protokollet har använts för att utvärdera uttrycket av kollagen och andra ECM-proteiner genom dermal fibroblaster isolerade från hypertrofisk ärr dermis och oengagerade intilliggande dermis. När odlas i MMC miljöer in vitro, har det observerats att hHSFs uttrycka vissa egenskaper (dvs. mRNA, biokemi, fysiologi och fenotyp) liknar dermal hypertrofisk ärrvävnad in vivo. Bevisen tyder på att fysiska och kemiska egenskaper är viktiga överväganden när man väljer crowders och optimera MMC villkor för odling in vitro.
För proof-of-princip, mmc-protokollet tillämpas här för att kvalitativt och kvantitativt utvärdera förmåga Shikonin och dess analoger att inducera apoptos. Detta gör det möjligt att utvärdera de potentiella tillämpningarna av dessa naturligt härledda traditionell kinesisk medicin (TCM) föreningar för hantering av dermal ärrbildning13. Trots detta mmc-protokolls enkelhet, kostnadseffektivitet och aktualitet uppfyller detta IN VITRO MMC-protokoll också de senaste bestämmelserna för att eliminera försök på däggdjur genom EU-direktiv 2010/63/EU och U.S. Environmental Protection Agency (EPA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll syftar till att optimera och autentisera en förbättrad : ärr-in-a-jar “in vitro-modell för mänskliga testning ärrvävnad. Tidigare studier har rapporterat tillämpningen av MMC teknik till mänskliga lungfibroblaster12, mänskliga benmärg mesenkymala stamceller23, och mänskliga dermal fibroblaster23 med dextran12, Ficoll12, och PVP23 som crowders. I studie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av finansiering från Singapores Agency for Science, Technology and Research “SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research” och “Wound Care Innovation for the Tropics” IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Författarna erkänner tacksamt råd och hjälp från Dr Paula Benny och Dr Michael Raghunath.
Materials
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of “macromolecular crowding” in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture – A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).
