Summary

Metodo di genetica inversa semplificato per recuperare rotavirus ricombinanti che esprimono proteine Reporter

Published: April 17, 2020
doi:

Summary

La generazione di rotavirus ricombinanti dal DNA plasmide fornisce uno strumento essenziale per lo studio della replicazione e della patogenesi del rotavirus e per lo sviluppo di vettori e vaccini di espressione del rotavirus. Qui, descriviamo un approccio semplificato di genetica inversa per la generazione di rotavirus ricombinanti, compresi ceppi che esprimono proteine reporter fluorescenti.

Abstract

I rotavirus sono una grande e in continua evoluzione di virus segmentati dell’RNA a doppio filamento che causano una grave gastroenterite nei giovani di molte specie di mammiferi e aviari, compresi gli esseri umani. Con il recente avvento dei sistemi di genetica inversa del rotavirus, è diventato possibile utilizzare la mutagenesi diretta per esplorare la biologia del rotavirus, modificare e ottimizzare i vaccini esistenti sul rotavirus e sviluppare vettori di vaccino multitarget del rotavirus. In questa relazione, descriviamo un sistema di genetica inversa semplificato che consente il recupero efficiente e affidabile dei rotavirus ricombinanti. Il sistema si basa sulla co-trascrizione di vettori di trascrizione T7 che esprimono rotavirus a lunghezza intera e su un vettore CMV che codifica un enzima di aggancio dell’RNA nelle cellule BHK producendo constitutively produrre polimerasi T7 RNA (BHK-T7). I rotavirus ricombinanti sono amplificati sovrasseminando le cellule BHK-T7 trafette con cellule MA104, una linea cellulare renale delle scimmie che è altamente permissiva per la crescita del virus. In questo rapporto, descriviamo anche un approccio per generare rotavirus ricombinanti che esprimono una proteina reporter fluorescente separata attraverso l’introduzione di un elemento di stop-restart traslazionale 2A nel segmento 7 del genoma (NSP3). Questo approccio evita di cancellare o modificare uno qualsiasi dei fotogrammi di lettura aperti virali, consentendo così la produzione di rotavirus ricombinanti che mantengono proteine virali completamente funzionali e allo stesso tempo di esprimere una proteina fluorescente.

Introduction

I rotavirus sono le principali cause di gastroenterite grave nei neonati e nei bambini piccoli, così come i giovani di molti altri mammiferi e specie aviarie1. Come membri della famiglia Reoviridae, i rotavirus hanno un genoma di RNA a doppio filamento (dsRNA) segmentato. I segmenti del genoma sono contenuti all’interno di un virione icosaedro non avvolto formato da tre strati concentrici di proteine2. Sulla base del sequenziamento e dell’analisi filogenetica dei segmenti del genoma, sono state definite nove specie di rotavirus (A, D, F,J)3. I ceppi che comprendono la specie a rotavirus A sono responsabili della stragrande maggioranza delle malattie umane4. L’introduzione di vaccini rotavirus nei programmi di immunizzazione infantile a partire dall’ultimo decennio è correlata a riduzioni significative della mortalità e morbilità del rotavirus. In particolare, il numero di decessi infantili associati al rotavirus è diminuito da circa 528.000 nel 2000 a 128.500 nel 20164,5. I vaccini Rotavirus sono formulati da ceppi vivi attenuati del virus, con 2 a 3 dosi somministrate ai bambini entro i 6 mesi di età. Il gran numero di ceppi di rotavirus geneticamente diversi che circolano negli esseri umani e in altre specie di mammiferi, combinato con la loro capacità di evolversi rapidamente attraverso la mutagenesi e il riassortimento, può portare a cambiamenti antigenici nei tipi di rotavirus che infettano i bambini6,7,8. Tali cambiamenti possono compromettere l’efficacia dei vaccini esistenti, richiedendone la sostituzione o la modifica.

Lo sviluppo di sistemi di genetica inversa completamente basati su plasmide che consentono la manipolazione di uno qualsiasi degli 11 segmenti del genoma del rotavirus è stato raggiunto solo di recente9. Con la disponibilità di questi sistemi, è diventato possibile svelare i dettagli molecolari della replicazione del rotavirus e della patogenesi, sviluppare migliori metodi di screening ad alto throughput per i composti anti-rotavirus e creare nuove classi potenzialmente più efficaci di vaccini rotavirus. Durante la replicazione del rotavirus, gli RNA con tappo non solo guidano la sintesi delle proteine virali, ma fungono anche da modelli per la sintesi dei segmenti del genoma della progenie dsRNA10,11. Tutti i sistemi di genetica inversa del rotavirus descritti fino ad oggi si basano sulla trasfezione dei vettori di trascrizione T7 nelle linee cellulari dei mammiferi come fonte di RNA derivati da cDNA , utilizzati per recuperare virus ricombinanti9,12,13. All’interno dei vettori di trascrizione, i cDNA virali a tutta lunghezza sono posizionati tra un promotore T7 a monte e il virus dell’epatite delta a valle (HDV) ribozyme in modo tale che gli RNA virali sono sintetizzati da polimerasi T7 RNA che contengono autentici 5′ e 3 termini(Figura 1A). Nel sistema di genetica inversa di prima generazione, i virus ricombinanti sono stati fatti traducendo cellule renali del criceto per bambini che esprimono la polimerasi t7 RNA (BHK-T7) con 11 vettori di trascrizione T7 (pT7), ogni sintesi diretta di un unico (-)RNA del ceppo virus simian SA11, e tre plasmidi di espressione promotore-drive CMV, uno che codifica la proteina di fusione aviaria reovirus p10FAST e due sottounità di codifica del virus vaccini D1R-D12L filare enzima complesso9. I virus SA11 ricombinanti generati nelle cellule BHK-T7 trasfette sono stati amplificati dal semina con cellule MA104, una linea cellulare permissiva per la crescita del rotavirus. È stata descritta una versione modificata del sistema di genetica inversa di prima generazione che non utilizza più plasmidi di supporto12. Invece, il sistema modificato genera con successo rotavirus ricombinanti semplicemente traducendo le cellule BHK-T7 con i 11 vettori di trascrizione SA11 T7, con l’avvertenza che i vettori per la fabbrica virale (viroplasmo) blocchi costitutivi (proteine non strutturali NSP2 e NSP5) vengono aggiunti a livelli 3 volte superiori rispetto agli altri vettori14,15. Sono state sviluppate anche versioni modificate del sistema di genetica inversa che supportano il recupero dei ceppi umani KU e Odelia del rotavirus16,17. Il genoma del rotavirus è notevolmente suscettibile alla manipolazione da parte della genetica inversa, con virus ricombinanti generati fino ad oggi con mutazioni introdotte in VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21e NSP522,23. Tra i virus più utili generati finora ci sono quelli che sono stati progettati per esprimere proteine reporter fluorescenti (FP)9,12,21,24,25.

In questa pubblicazione, forniamo il protocollo per il sistema di genetica inversa che usiamo nel nostro laboratorio per generare ceppi ricombinanti del rotavirus SA11. La caratteristica chiave del nostro protocollo è la co-transfezione delle cellule BHK-T7 con i vettori di trascrizione 11 pT7 (modificati per includere livelli 3x dei vettori pT7/NSP2SA11 e pT7/NSP5SA11) e unFigure 2vettore di espressione CMV che codifica il virus della peste suina africana (ASFV) NP868R).21 Nelle nostre mani, la presenza del plasmide NP868R porta alla produzione di più alti titer di virus ricombinanti da parte di cellule BHK-T7 trafette. In questa pubblicazione, forniamo anche un protocollo per modificare il pLasmide pT7/NSP3SA11 in modo che possano essere generati virus ricombinanti che esprimono non solo il prodotto proteico segmento 7 NSP3 ma anche un FP separato. Questa operazione viene eseguita ri-ingegnerizzando il frame di lettura aperto NSP3 (ORF) nel plasmid pT7/NSP3SA11 per contenere un elemento downstream 2A di arresto traslazionale 2A seguito da un FP ORF (Figura 1B)24,26. Attraverso questo approccio, abbiamo generato rotavirus ricombinanti che esprimono vari FP: UnaG (verde), mKate (molto rosso), mRuby (rosso), TagBFP (blu), CFP (ciano) e YFP (giallo)24,27,28. Questi rotavirus che esprimono FP sono fatti senza eliminare l’OrF NSP3, producendo così virus che dovrebbero codificare un completo complemento di proteine virali funzionanti.

Protocol

1. Preparazione dei supporti e manutenzione della coltura cellulare Ottenere cellule renali di criceto bambino che esprimono le cellule del rene T7 RNA (BHK-T7) e il rene della scimmia verde africana MA104.NOTA: Le cellule BHK-T7 (o BSR-T7) non sono disponibili in commercio, ma sono una linea cellulare comune di laboratori che utilizzano la genetica inversa per studiare la biologia del virus dell’RNA. La linea cellulare BHK-T7 utilizzata in questo protocollo è stata ottenuta dalla Dott.ssa Ursula J. Buchho…

Representative Results

Il protocollo di genetica inversa descritto in questo articolo procede attraverso più passaggi distinti: (1) co-trasfezione di cellule BHK-T7 con vettori di trascrizione del rotavirus pT7 e pCMV/NP868R espressione plasmid, (2) semina di cellule BHK-T7 trafette con cellule MA104, (3) amplificazione dei virus ricombinanti presenti nelle cellule BHK-T7/MA104 che utilizzano cellule MA104 e (4) isolamento della placca del virus ricombinante utilizzando cellule MA104(Figura 2). Nelle nostre mani,…

Discussion

Nel nostro laboratorio, ci affidiamo regolarmente al protocollo di genetica inversa descritto qui per produrre rotavirus SA11 ricombinanti. Con questo approccio, gli individui con poca esperienza nelle tecniche di biologia molecolare o che lavorano con i rotavirus recuperano i virus ricombinanti anche al loro primo tentativo. Abbiamo generato quasi 100 virus ricombinanti seguendo questo protocollo, compresi quelli con genomi che sono stati riprogettati per esprimere proteine estranee (ad esempio, SP) e che contengono agg…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da NIH sovvenzioni R03 AI131072 e R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding, e il Lawrence M. Blatt Endowment. Ringraziamo i membri del laboratorio IU Rotahoosier, Ulrich Desselberger, e Guido Papa per i loro numerosi contributi e suggerimenti nello sviluppo del protocollo di genetica inversa.

Materials

Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov
Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel Bio-Rad 45608105
Cellometer AutoT4 viable cell counter Nexcelom
ChemiDoc MP Gel Imaging System Bio-Rad
Chloroform MP 194002
Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate Bio-Rad 170-5060
Competent E.coli DH5alpha Bacteria Lucigen 60602-2
Complete Protease Inhibitor Pierce A32965
Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips MTC Bio P4113-11
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Lonza 12-604F
Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) Quality Biological 115-073-101
Ethanol, Absolute (200 proof) Fisher Bioreagents BP2818-500
Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) Invitrogen 15585-011
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated Corning 35-011-CV
Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal Sigma-Aldrich F1804
GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit Sigma NA0200-1KT
Geneticin (G-418) Invitrogen 10131-027
Gibco FluroBrite DMEM ThermoFisher A1896701 DMEM with low background fluorescence
Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) Gibco 11710-035
Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated Cell-Signaling Technology 7074S
Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum Patton lab lot 55068
Guinea Pig Anti-VP6 Antierum Patton lab lot 53963
Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated KPL 5220-0366
Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated Cell-Signaling Technology 7076S
iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit JH Science 25235
Isopropyl alcohol Macron 3032-02
L-glutamine Solution (100x) Gibco 25030-081
Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) RPI research products L24020-2000.0
Medium 199 (M199) Culture Medium Hyclone Sh30253.01
Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) Lonza 04-719Q
Monkey Kidney (MA104) Cells ATCC ATCC CRL-2378.1
NanoDrop One Spectrophotometer ThermoScientific
Neutral Red Solution (0.33%) Sigma-Aldrich N2889-100ml
Non-Essential Amino Acid Solution (100x) Gibco 11140-050
Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel Invitrogen XP00102BOX
Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water Invitrogen 10977-015
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit Takara 740609.25
Opti-MEM Reduced Serum Medium Gibco 31985-070
Pellet pestle (RNase-free, disposable) Fisher 12-141-368
Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) Corning 30-002-Cl
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Fisher Bioreagents BP399-20
Porcine Trypsin, Type IX-S Sigma-Aldrich T0303
PureYield Plasmid Miniprep System Promega A1223
Qiagen Plasmid Maxi Kit Qiagen 12162
Qiagen Plasmid Midi Kit Qiagen 12143
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104
SA11 pT7 Transcription Vectors Addgene 89162-89172
SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins Contact: jtpatton@iu.edu
SeaKem LE Agarose Lonza 50000 For gel electrophoresis
SeaPlaque agarose Lonza 50100 For plaque assay
Superscript III One-Step RT-PCR kit Invitrogen 12574-035
Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad 170-4270
Trans-Llot Turbo Transfer System Bio-Rad
TransIT-LTI Transfection Reagent Mirus MIR2306
Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) Bio-Rad 161-0772
Triton X 100 Fisher Bioreagents BP151-500
Trizol RNA Extraction Reagent Ambion 15596026
Trypan blue Corning 25-900-CI
Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution Quality Biological 118-087-721
Tryptose Phosphate Broth Gibco 18050-039
Tween-20 VWR 0777-1L
Vertrel VF solvent Zoro G0707178
Zoe Fluorescent Live Cell Imager Bio-Rad

References

  1. Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
  2. Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
  3. . Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019)
  4. Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, 96-105 (2016).
  5. Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
  6. Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
  7. McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
  8. Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
  9. Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
  10. Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
  11. Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
  12. Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
  13. Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
  14. Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
  15. Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
  16. Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
  17. Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
  18. Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
  19. Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
  20. Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
  21. Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
  22. Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
  23. Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
  24. Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
  25. Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
  26. Donnelly, M. L., et al. The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’ sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
  27. Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
  28. Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
  29. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
  30. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , (2009).
  31. Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
  32. Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).

Play Video

Cite This Article
Philip, A. A., Dai, J., Katen, S. P., Patton, J. T. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (158), e61039, doi:10.3791/61039 (2020).

View Video