Anwendung der Atomkraftmikroskopie zur Erkennung früher Osteoarthritis
Summary
Wir präsentieren eine Methode zur Untersuchung früher osteoarthritischer Veränderungen auf zellulärer Ebene im Gelenkknorpel mittels Atomkraftmikroskopie (AFM).
Abstract
Biomechanische Eigenschaften von Zellen und Geweben regulieren nicht nur ihre Form und Funktion, sondern sind auch entscheidend für die Erhaltung ihrer Vitalität. Veränderungen der Elastizität können sich ausbreiten oder das Auslösen von schweren Krankheiten wie Krebs oder Arthrose (OA) auslösen. Die Atomkraftmikroskopie (AFM) hat sich zu einem starken Werkzeug entwickelt, um die biomechanischen Eigenschaften spezifischer biologischer Zielstrukturen auf mikroskopischer Ebene qualitativ und quantitativ zu charakterisieren und Kräfte in einem Bereich von so klein wie dem Piconewton bis zum Mikronewton zu messen. Biomechanische Eigenschaften sind von besonderer Bedeutung bei Muskel-Skelett-Geweben, die hohen Belastungen ausgesetzt sind. OA als degenerative Erkrankung des Knorpels führt zur Störung der perizellulären Matrix (PCM) und zur räumlichen Neuanordnung der in ihre extrazelluläre Matrix (ECM) eingebetteten Chondrozyten. Störungen in PCM und ECM wurden mit Veränderungen der biomechanischen Eigenschaften des Knorpels in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Studie haben wir AFM verwendet, um diese Veränderungen in Bezug auf die spezifischen räumlichen Musteränderungen der Chondrozyten zu quantifizieren. Mit jeder Musteränderung wurden signifikante Veränderungen der Elastizität sowohl für das PCM als auch für das ECM beobachtet. Die Messung der lokalen Elastizität ermöglicht somit direkte Rückschlüsse auf den Grad der lokalen Gewebedegeneration in OA.
Introduction
Gelenkknorpel ist ein avaskuläres, aneurales Gewebe. Spärlich verstreute Chondrozyten produzieren, organisieren und pflegen eine expansive extrazelluläre Matrix (ECM), in die sie eingebettet sind. Als eigenständiger und spezialisierter Teil des ECM sind Chondrozyten von einer dünnen Schicht spezialisierter Matrix umgeben, die als perizelluläre Matrix (PCM) bekannt ist. Das PCM fungiert als mechanosensitive Zellmatrix-Schnittstelle1, die die Chondrozyten2 schützt und ihre biosynthetische Reaktion moduliert3. Wie bereits beschrieben4, sind Chondrozyten in gesunden Knorpeln in spezifischen, unterschiedlichen räumlichen Mustern angeordnet, die für jede Gewebeschicht und jedes Gelenk4,5 spezifisch sind und von gelenkspezifischen mechanischen Lademechanismen abhängen6. Diese Muster ändern sich mit Beginn der Arthrose (OA) von Paaren und Saiten im gesunden Knorpel zu Doppeltenitern. Mit dem weiteren Fortschreiten der Krankheit bilden die Chondrozyten kleine Cluster, die allmählich zu großen Clustern in fortgeschrittenen OA anwachsen. Ein vollständiger Verlust jeglicher Organisationsstruktur und Induktion von Apoptose wird in der Endstufe OA beobachtet. Somit kann Chondrozyten-Zellanordnung als bildbasierter Biomarker für OA-Progression4verwendet werden.
Biomechanische Eigenschaften von Zellen und Geweben regulieren nicht nur ihre Form und Funktion, sondern sind auch entscheidend für die Erhaltung ihrer Vitalität. Veränderungen der Elastizität können sich ausbreiten oder den Beginn von schweren Krankheiten wie Krebs oder OA auslösen. Die Atomkraftmikroskopie (AFM) hat sich zu einem leistungsfähigen Werkzeug entwickelt, um die biomechanischen Eigenschaften spezifischer biologischer Zielstrukturen auf mikroskopischer Ebene qualitativ und quantitativ zu charakterisieren und dabei ein breites Spektrum an Kraft von Piconewton bis Mikronewton zu messen. Die Hauptanwendung von AFM ist die Messung der Oberflächentopographie und der mechanischen Eigenschaften von Proben mit Subnanometer-Auflösung7. Das Messgerät besteht aus drei Hauptkomponenten: 1) Eine AFM-Sonde, die eine scharfe Spitze ist, die auf einem Ausleger montiert ist und für die direkte Interaktion mit der Oberfläche der Probe verwendet wird. Wenn Kraft auf den Ausleger ausgeübt wird, tritt eine Verformung des letzteren entsprechend den Eigenschaften des gemessenen Gewebes auf. 2) Ein optisches System, das einen Laserstrahl auf den Ausleger projiziert, der dann auf eine Detektoreinheit reflektiert wird. 3) Ein Photodiodendetektor, der das vom Ausleger abgelenkte Licht einfängt. Es wandelt die empfangenen Informationen über die Laserverformung durch den Ausleger in eine Kraftkurve um, die analysiert werden kann.
Das Hauptprinzip von AFM ist daher die Detektion der Kraft, die zwischen der AFM-Sonde und der Zielstruktur der Probe wirkt. Die erhaltenen Kraftkurven beschreiben die mechanischen Eigenschaften der Zielstrukturen auf der Probenoberfläche wie Elastizität, Ladungsverteilung, Magnetisierung, Streckgrenze und elastische plastische Verformungsdynamik8. Ein wichtiger Vorteil von AFM gegenüber anderen bildgebenden Verfahren ist, dass AFM verwendet werden kann, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen in mittleren oder Geweben in einem nativen Zustand zu messen, ohne das Gewebe zu beschädigen. AFM kann sowohl in flüssigen als auch trockenen Bedingungen betrieben werden. Eine Probenvorbereitung ist nicht erforderlich. AFM bietet die Möglichkeit, eine Probe abzubilden und ihre mechanischen Eigenschaften gleichzeitig in Proben zu messen, die sich in der Nähe physiologischer Bedingungen befinden. In der vorliegenden Studie beschreiben wir einen neuartigen Ansatz zur Beurteilung der OA-Progression, indem wir die Elastizität von PCM und ECM im nativen Gelenkknorpel messen. Die Korrelation der räumlichen Organisation von Chondrozyten mit dem Grad der lokalen Gewebedegeneration bietet eine völlig neue Perspektive für die Früherkennung von OA. Die funktionale Relevanz dieser Muster wurde jedoch bisher nicht bewertet. Da die Hauptfunktion des Gelenkknorpels das Tragen bei geringer Reibung ist, muss das Gewebe elastische Eigenschaften besitzen. AFM ermöglicht es, nicht nur die Elastizität des ECM zu messen, sondern auch die räumlichen zellulären Muster, die in ihr PCM eingebettet sind. Die beobachtete Korrelation der Elastizität mit der räumlichen Musteränderung der Chondrozyten ist so stark, dass die Messung der Elastizität allein eine Schichtung der lokalen Gewebedegeneration ermöglichen kann.
Die elastischen Module des PCM und des ECM wurden in 35 m dünnen Abschnitten mit einem Invertierten Phasenkontrastmikroskop untersucht, das eine gleichzeitige Visualisierung der Knorpelprobe ermöglichte. Dieses Protokoll basiert auf einer bereits aus unserem Labor9 veröffentlichten Studie und beschreibt speziell, wie die räumliche Anordnung der Chondrozyten charakterisiert und wie die Elastizität der zugehörigen PCM und ECM gemessen werden kann. Bei jeder Musteränderung der Chondrozyten können auch signifikante Veränderungen der Elastizität sowohl für das PCM als auch für das ECM beobachtet werden, so dass diese Technik verwendet werden kann, um das Stadium der Degeneration des Knorpels direkt zu messen.
Dieser validierte Ansatz eröffnet eine neue Möglichkeit, die OA-Progression und die therapeutischen Wirkungen in frühen Stadien zu bewerten, bevor der makroskopische Gewebeabbau tatsächlich auftritt. AFM-Messungen konsequent durchzuführen, ist ein mühsamer Prozess. Im folgenden Protokoll beschreiben wir, wie man die von AFM zu messende Probe vorbereitet, wie man die tatsächlichen AFM-Messungen ab der Vorbereitung des Auslegers durchführt, wie man den AFM kalibriert und wie man dann die Messungen durchführt. Schritt-für-Schritt-Anleitungen geben einen klaren und präzisen Ansatz, um zuverlässige Daten zu erhalten und grundlegende Strategien für deren Verarbeitung und Interpretation bereitzustellen. Im Diskussionsabschnitt werden auch die häufigsten Fallstricke dieser strengen Methode beschrieben und hilfreiche Tipps zur Fehlerbehebung gegeben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit AFM als neuartige und leistungsstarke Technik zur Messung der biomechanischen Eigenschaften biologischer Materialien auf nanoskaliger Ebene haben wir die elastischen Eigenschaften von ECM und PCM im menschlichen osteoarthritischen Gelenkknorpel gemessen. Knorpelproben wurden nach ihrem vorherrschenden räumlichen Muster der Chondrozytenorganisation als bildbasierter Biomarker für die lokale Gewebedegeneration ausgewählt. Erwartungsgemäß wurde ein starker Rückgang der Elastizitätswerte sowohl von ECM als auch vo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken unseren Co-Autoren aus der Originalpublikation für ihre Hilfe und Unterstützung.
Materials
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
References
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