Количественная оценка норовируса человека, как частицы, связывающиеся с commensal бактерий использованием потока цитометрии
Summary
Целью этого протокола является количественная оценка связывания эукариотического патогена норовируса человека к бактериям. После выполнения первоначального вирусно-бактериальных вложений асссее, цитометрия потока используется для обнаружения вирусно связанных бактерий в популяции.
Abstract
Комменсальные бактерии хорошо известны для воздействия инфекции эукариотических вирусов. Прямая связывание между патогеном и микробиомом хозяина отвечает за изменение инфекции для многих из этих вирусов. Таким образом, характеристика природы связывания вирусов-бактерий является основополагающим шагом, необходимым для выяснения механизма (ы), с помощью которого бактерии изменяют вирусную инфекцию. Для человека норовирус, комменсальные бактерии повышения B-клеточной инфекции. Вирус непосредственно связывается с этими бактериями, указывая, что это прямое взаимодействие участвует в механизме повышения инфекции. Различные методы могут быть использованы для количественной оценки взаимодействия между бактериями и вирусами, включая сцинтилляционный подсчет радиомаркированных вирусов и полимеразы цепной реакции (ПЦР). Оба метода требуют использования живого вируса, который, возможно, потребуется сгенерировать в лаборатории. В настоящее время ни одна из установленных систем культуры in vitro, доступных для норовируса человека, не является достаточно надежной, чтобы обеспечить генерацию высококонцентрированных вирусных запасов. Вместо живого вируса, вирусоподобные частицы (VLPs) были использованы для характеристики взаимодействия между норовирусом и бактериями. В этом методциометрии потока описан с использованием вируса специфические антитела для количественной оценки Связывания VLP к грамотрицательным и грамотрицательным бактериям. Включение как бактерий только и изотип контроля позволило для оптимизации асссы, чтобы уменьшить связывание фоновых антител и точной количественной vLP привязанности к бактериям испытания. Высокое соотношение VLP:бактерии приводит к связыванию VLPs к большому проценту бактериальной популяции. Однако, когда количество VLP уменьшается, процент бактерий связаны также уменьшается. В конечном счете, этот метод может быть использован в будущих экспериментах выяснение конкретных условий и структурных компонентов, которые регулируют норовирус: бактериальные взаимодействия.
Introduction
Норовирусы человека (HuNoVs) являются ведущей причиной желудочно-кишечных заболеваний во всем мире, ответственных за 685 миллионов инфекций и более 200000 смертей каждый год1. Как и в случае с другими кишечными вирусами, присутствие комменсальных бактерий было показано для повышения инфекции этого патогена, а также его суррогатного вируса, норовирус минына2,3. Есть также противоречивые сообщения о том, что бактерии могут ингибировать инфекцию человека норовирус4,5,6. Для нескольких вирусов, прямое взаимодействие между вирусом и бактериями, как представляется, лежат в основе механизмов, которые влияют на вирусную инфекцию2,7,8,9,10, и было показано с помощью электронной микроскопии, что норовирусы человека связываются непосредственно на поверхности бактерий11,12. Таким образом, характеристика этих взаимодействий стала критической для определения механизмов, с помощью которых бактерии воздействия вирусной инфекции. Эта характеристика классически началась с количественной вирусной привязки к массиву бактериальных видов, которые являются компонентами микробиома-хозяина7,12,13. Эти исследования привязанности не только выявить количество вируса связаны с бактериями, но и помочь в определении воздействия этого взаимодействия на вирусные фитнес и выживание.
Для количественной оценки вирусного вложения, традиционно используемые методы включают ПЦР-анализы, которые количественно вирусных геномов12 или поколения радиоlabeled вируса и использование сцинтилляции подсчета для количественной оценки вирусных частиц7,8,9,13. Использование этих методов, как правило, требует доступа к высоким запасам вируса и методам культивирования in vitro, с помощью которых они генерируются. Хотя несколько систем культуры для человека норовирус в настоящее время существуют2,14,15, ни одна поддержка надежной репликации, необходимой для создания этих высококонцентрированных запасов, который ограничивает или исключает использование ПЦР и сцинтилляции подсчета для количественной оценки человека норовирус / бактериальные взаимодействия.
Чтобы обойти эту проблему, вирусоподобные частицы (VLPs) могут быть использованы в качестве суррогата живого вируса для исследования взаимодействий между норовирусом человека и бактериями16,17. ВЛП являются неинфекционными частицами, которые очень похожи на вирус, из которого они получены. В случае норовируса человека эти частицы генерируются из экспрессии белка VP1 (и когда-то VP2), который самостоятельно собирается для создания нетронутых вирусных капсидов, не обладающих генетическим материалом (т.е. РНК для норовирусов). Эти VLPs были хорошо охарактеризованы, структурно и антигенно похожи на вирусы дикого типа, из которых они выведены18,19,20,21,22,23. Таким образом, VLPs служить в качестве идеального суррогата для исследования поверхностных взаимодействий между норовирусом человека и commensal бактерий. Учитывая, что VLPs не хватает генетического материала, ПЦР-анализы не могут быть использованы для количественной оценки вирусной связывания. Метод цитометрии на основе антител был описан ранее и способен обнаружить низкие уровни связывания VLP с бактериями в полуколичественной манере16. Этот метод был оптимизирован для обеспечения точной количественной оценки связывания норовируса человека VLP как для грамотрицательных, так и для грамотрицательных комменсальных бактерий16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Способность количественно связывать энтерические вирусы с бактериями является важным первым шагом для выяснения механизмов, с помощью которых эти бактерии изменяют вирусную инфекцию. Методы, описанные в настоящем случае, были оптимизированы для измерения взаимодей…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Сутонуку Бхар и Шанель Мосби-Хаундруп за критический обзор письменной рукописи, а также Альфонсо Каррильо за помощь в создании кривых бактериальных стандартов. Эта работа частично финансируется за счет гранта Национального института здравоохранения (R21AI140012) и гранта на семена от Университета Флориды, Института пищевых и сельскохозяйственных наук.
Materials
| 5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap | Corning | 352235 | After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis. |
| Agar | Sigma | A7002 | Used for media preparation |
| AnaeroPack | Thermo Scientific | R681001 | Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri |
| BD FacsDiva software | |||
| BD LSR Fortessa flow cytometer | |||
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605 | Used for flow cytometry |
| Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) | BD Biosciences | 554657 | Used for flow cytometry |
| Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience | Thermo Fisher Scientific | 12473281 | Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer. |
| MRS Powder | BD Biosciences | 288130 | Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri. |
| Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) | Thermo Fisher Scientific | MA5-18241 | Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher. |
| Norovirus GII.4 VLP | Creative Biostructure | CBS-V700 | human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays. |
| PBS 10X | Fisher Bioreagents | BP665 | Dilute to 1X prior to use. |
| SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | S10467 | Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody. |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Used for media preparation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Used for media preparation |
| Tube Revolver | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm). |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | Used for media preparation |
References
- Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
- Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
- Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017 (2016).
- Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).
- Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559 (2017).
- Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
- Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
- Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).
- Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
- Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
- Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
- Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).
- Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).
- Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).
- Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
- Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
- Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
- Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
- Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), 287-290 (1999).
- Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
- Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).
- Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).
