Summary

Flow Cytometric Analyse der Lymphozyteninfiltration im Zentralnervensystem während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis

Published: November 17, 2020
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Summary

Dieses Manuskript stellt ein Protokoll zur Induzieren von aktiver experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) bei Mäusen dar. Eine Methode zur Isolierung und Charakterisierung der infiltrierten Lymphozyten im Zentralnervensystem (ZNS) wird ebenfalls vorgestellt, um zu zeigen, wie Lymphozyten an der Entwicklung einer CNS-Autoimmunerkrankung beteiligt sind.

Abstract

Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunerkrankung des Zentralnervensystems (ZNS), die durch die Kombination von Umweltfaktoren und empfänglichem genetischen Hintergrund verursacht wird. Experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) ist ein typisches Krankheitsmodell von MS, das weit verbreitet ist, um die Pathogenese zu untersuchen, bei der T-Lymphozyten, die speziell für Myelin-Antigene sind, eine Entzündungsreaktion bei ZNS auslösen. Es ist sehr wichtig zu beurteilen, wie Lymphozyten im ZNS die Entwicklung von Krankheiten regulieren. Der Ansatz zur Messung der Menge und Qualität infiltrierter Lymphozyten im ZNS ist jedoch aufgrund der Schwierigkeiten bei der Isolierung und Detektion infiltrierter Lymphozyten aus dem Gehirn sehr begrenzt. Dieses Manuskript enthält ein Protokoll, das für die Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung infiltrierter Lymphozyten aus dem ZNS nützlich ist und hilfreich für unser Verständnis der Rolle der Lymphozyten bei der Entwicklung der CNS-Autoimmunerkrankung sein wird.

Introduction

Als chronische demyelinisierende Erkrankung des ZNS betrifft MS etwa 2,5 Millionen Menschen weltweit und es fehlt an kurativen Behandlungen1. Es gilt auch als eine Autoimmunerkrankung, bei der Myelin-Antigen-spezifische T-Lymphozyten eine Entzündungsreaktion auslösen und zu Demyelination und Axonalverletzungen im ZNS2führen. Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) wurde weit verbreitet verwendet, um pathogene Mechanismen von MS als klassisches Autoimmun-Demyelination-Krankheitsmodell in CNS3zu untersuchen. Es gibt zwei Möglichkeiten, EAE zu induzieren: eine besteht darin, EAE aktiv durch Immunisierung von Tieren mit Myelinkomponenten zu induzieren, eine andere ist der Adoptivtransfer durch Übertragung enzephalitogener T-Zellen in Rezeptor2,4,5. Die Anfälligkeit für EAE unterscheidet sich in verschiedenen Tierstämmen6. Bei C57BL/6-Mäusen induziert Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) 35–55-Herausforderung eine monophasische Erkrankung mit umfangreicher Demyelination und Entzündung im ZNS, die häufig in Experimenten mit gengezielten Mäusen verwendet wird7.

Die Erzeugung von Myelin-spezifischen reaktiven T-Zellen ist für das Auftreten und die Entwicklung von Krankheiten bei EAE erforderlich und ist ein immunologisches Zeichen von EAE und MS. Aktivierte autoreaktive T-Lymphozyten überqueren die Blut-Hirn-Schranke (BBB) in das gesunde ZNS und initiieren EAE-Krankheit. Wenn MOG 35–55 Ag angetroffen wird, induzieren diese T-Lymphozyten Entzündungen und die Rekrutierung von Effektorzellen in das ZNS, was zu Demyelination und Axonzerstörung8,9führt. Im EAE-Modell gibt es genügend Hinweise darauf, dass neuroantigenspezifische CD4+ T-Zellen Neuroinflammation und Pathologie3,10initiieren und aufrecht erhalten können. Je nach den wichtigsten produzierten Zytokinen wurden CD4+ T-Lymphozyten in verschiedene Teilmengen eingeteilt: Th1 (gekennzeichnet durch die Produktion von Interferon-γ), Th2 (gekennzeichnet durch die Produktion von Interleukin 4) und Th17 (gekennzeichnet durch die Produktion von Interleukin 17). Es wird angenommen, dass die Aktivierung von Th1- und Th17-Zellen zur Induktion, Wartung und Regulierung der entzündlichen Demyelination bei EAE und MS beiträgt, indem sie die Effektor-Zytokine IFN-γ und IL-17 sezernieren, die in der Lage sind, Makrophagen zu aktivieren und Neutrophile an den entzündlichen Stellen zu rekrutieren, um die Läsionen zu beschleunigen11.

Da autoreaktive T-Zellen die BBB in das ZNS kreuzen und die Entwicklung von Krankheiten bei MS und EAE induzieren, ist es sehr wichtig, T-Zellen im ZNS zu analysieren. Es gibt jedoch nur sehr wenige etablierte Protokolle für die Isolierung von Lymphozyten aus dem ZNS12. Daher wurde eine Methode entwickelt, die für die Isolierung mononukleantin Zellen aus dem Gehirn und die Analyse von T-Lymphozyten mit den Markern CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g und IL-17 für die Durchflusszytometrie optimiert ist. Die Methode verwendet MOG35–55 adjuvant Mycobacterium tuberculosis H37 Ra und Pertussis Toxin Working Solution (PTX), um ein aktives Immunisierungsmodell von EAE bei Mäusen zu induzieren. Anschließend werden mechanische Trenn- und Dichtegradientenzentrifugationsmethoden zur Isolierung von Mononuklezellen von ZNS eingesetzt. Schließlich wird eine optimierte Flusszytometrie-Gating-Strategie verwendet, um T-Lymphozyten und Teilmengen aus dem Gehirn zu identifizieren, indem mehrere Marker gefärbt werden.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Tierausschuss der School of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University, genehmigt. 1. Herstellung der Materialien Verwenden Sie die MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK-Sequenz von MOG35–55, um das lyophilisierte Peptid aus kommerziellen Quellen zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die Reinheit des Peptids >95% beträgt. 10 mg/ml MOG-Stammlösung in phosphatgepufferter Saline (PBS) vorbereiten und bei -20 °C lagern. Bereiten Sie e…

Representative Results

Nach der Immunisierung von C57BL/6-Mäusen wurden alle Mäuse täglich auf neurologische Symptome gewogen, untersucht und eingestuft. Der repräsentative klinische Verlauf des EAE sollte zu einer Krankheitskurve führen, wie in Abbildung 2A dargestellt, und zu einer Veränderung des Körpergewichts in der Maus, wie in Abbildung 2Bdargestellt. C57BL/6 Mäuse, die mit MOG35-55 immunisiert wurden, begannen in der Regel um tag 10–12 Krankheitssymptome zu entwickel…

Discussion

Diese Studie präsentiert ein Protokoll zur Induktion und Überwachung von EAE mit MOG35-55 bei C57BL/6-Mäusen, die als typisches neuroimmunologisches Versuchstiermodell von MS gelten. EAE kann induziert werden, indem die Mäusestämme oder die Art des Proteins, das für die Induktion verwendet wird, entsprechend dem Zweck der Studie variiert werden. Beispielsweise kann die Verwendung von PLP139–151 Peptid bei SJL-Mäusen einen schubförmigen EAE-Krankheitsverlauf induzieren, der besonders gut geeignet ist, um therape…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde unterstützt durch national Natural Science Foundation of China Grant (31570921 an ZJ, 81571533 to LS), Shanghai Municipal Commission of Health, and Family Planning (201540206 to ZJ), Ruijin Hospital North research grant (2017ZX01 to ZJ).

Materials

Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 eBioscience 56-0454-82
Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block BioLegend 101302
APC anti-mouse IFN-g eBioscience 17-7311-82
BD LSRFortessa X-20 BD
Dounce homogenizer Wheaton 353107542
eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) eBioscience 00-4975-03
eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set eBioscience 88-8824-00
FITC anti-mouse CD3 BioLegend 100203
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400605
Freund's Adjuvant Complete (CFA) Sigma-Aldrich F5881
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience eBioscience 56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra Difco Laboratories 231141
PE anti-mouse IL-17A eBioscience 12-7177-81
PE/Cy7 anti-mouse CD4 BioLegend 100422
PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400617
Percoll GE 17-0891-01
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b BioLegend 101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400631
pertussis toxin (PTX) Sigma-Aldrich P-2980
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience eBioscience 17-4301-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience eBioscience 12-4321-80
Rat MOG35–55 peptides Biosynth International MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK

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Cite This Article
Ji, Z., Zhou, C., Niu, H., Wang, J., Shen, L. Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (165), e61050, doi:10.3791/61050 (2020).

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