Summary

זרימה ניתוח ציטומטרי של חדירה לימפוציטים במערכת העצבים המרכזית במהלך אנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית

Published: November 17, 2020
doi:

Summary

כתב יד זה מציג פרוטוקול כדי לגרום אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית פעילה (EAE) בעכברים. שיטה לבידוד ואפיון של לימפוציטים הסתננו במערכת העצבים המרכזית (CNS) מוצגת גם כדי להראות כיצד לימפוציטים מעורבים בהתפתחות של מחלת החיסון האוטואימונית CNS.

Abstract

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה אוטואימונית של מערכת העצבים המרכזית (CNS) הנגרמת על ידי שילוב של גורמים סביבתיים ורקע גנטי רגיש. אנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) הוא מודל מחלה טיפוסי של טרשת נפוצה בשימוש נרחב לחקירת הפתוגנזה שבה לימפוציטים T ספציפי לאנטיגנים מיאלינים ליזום תגובה דלקתית ב- CNS. חשוב מאוד להעריך כיצד לימפוציטים במערכת העצבים תסדיר את התפתחות המחלה. עם זאת, הגישה למדידת הכמות והאיכות של לימפוציטים חדרו ב-CNS מוגבלת מאוד בשל הקשיים בבידוד ואיתור לימפוציטים חדרו מהמוח. כתב יד זה מציג פרוטוקול לכך שימושי לבידוד, זיהוי, ואפיון של לימפוציטים הסתננו ממערכת העצבים הצרפתית ויהיה מועיל להבנתנו כיצד לימפוציטים מעורבים בפיתוח המחלה האוטואימונית CNS.

Introduction

כמחלה demyelinating כרונית של CNS, טרשת נפוצה משפיעה על 2.5 מיליון אנשים ברחבי העולם וחסר טיפוליםמרפאים 1. הוא נחשב גם מחלה אוטואימונית, שבה לימפוציטים T אנטיגן מימין ספציפיים ליזום תגובה דלקתית ולהוביל demyelination ופציעה סקסונית ב CNS2. אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) שימשה באופן נרחב כדי לחקור מנגנונים פתוגנים של טרשת נפוצה כמודל קלאסי מחלת דמיאליציה אוטואימונית ב CNS3. ישנן שתי דרכים לגרום EAE: אחת היא לגרום EAE באופן פעיל על ידי חיסון בעלי חיים עם רכיבים מילין, אחר הוא העברה מאמצת על ידי העברת תאי T encephalitogenic לתוךקולטן 2,,4,,5. הרגישות ל-EAE שונה בזני בעלי חייםשונים 6. בעכברים C57BL/6, מיטלין אוליגודנדרוציט גליקופרוטין (MOG) 35-55 אתגר גורם למחלה monophasic עם demyelination נרחב ודלקת ב-CNS, אשר משמש לעתים קרובות בניסויים עם עכברים ממוקדיםבגן 7.

הדור של תאי T תגובתיים ספציפיים מילין נדרש להתרחשות ופיתוח של מחלה בEAE והוא סימן חיסוני של EAE ו טרשת נפוצה. לימפוציטים T אוטומטי פעיל לחצות את מחסום מוח הדם (BBB) לתוך CNS בריא ליזום מחלת EAE. כאשר MOG 35-55 Ag נתקל, לימפוציטים T אלה לגרום לדלקת וגיוס של תאי אפקט לתוך CNS, וכתוצאה מכך demyelination והרס axon8,9. במודל EAE, יש ראיות רבות כי נוירואנטיגן ספציפי CD4+ T תאים יכולים ליזום ולקיים דלק עצבי ופתולוגיה3,,10. בהתאם ציטוקינים העיקריים המיוצרים, CD4+ T לימפוציטים סווגו לתוך קבוצות משנה שונות: Th1 (מאופיין בייצור של אינטרפרון-γ), Th2 (מאופיין בייצור של interleukin 4), ו Th17 (מאופיין בייצור של interleukin 17). הוא האמין כי ההפעלה של תאי Th1 ו Th17 לתרום אינדוקציה, תחזוקה, ורגולציה של demyelination דלקתי ב EAE ו טרשת נפוצה על ידי הפרשת ציטוקינות effector IFN-γ ו IL-17, אשר מסוגלים להפעיל מקרופאגים וגיוס נויטרופילים לאתרים דלקתיים כדי להאיץ אתהנגעים 11.

בגלל תאי T תגובה אוטומטית לחצות את BBB לתוך CNS ול לגרום להתפתחות המחלה ב-MS ו- EAE, חשוב מאוד לנתח תאי T ב-CNS. עם זאת, יש מעט מאוד פרוטוקולים מבוססים לבידוד של לימפוציטים מ CNS12. לכן, שיטה אופטימיזציה לבידוד תאים חד-נו-קוטריים מהמוח וניתוח לימפוציטים T עם סמנים CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g, ו IL-17 עבור ציתימטריית זרימה פותחה. השיטה משתמשת MOG35-55 adjuvant Mycobacterium שחפת H37 Ra ו פתרון עבודה רעלן Pertussis (PTX) כדי לגרום מודל חיסון פעיל של EAE בעכברים. לאחר מכן, שיטות צנטריפוגציה הדרגתית של הפרדה מכנית ושיפוע צפיפות משמשים לבידוד של תאים חד-נו-נו-קוטביים CNS. לבסוף, אסטרטגיה ממוטבת cytometry gating זרימה משמש כדי לזהות לימפוציטים T ותת קבוצות מהמוח על ידי הכתמת סמנים מרובים.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ועדת בעלי החיים של בית הספר למדעי הרפואה הבסיסיים, אוניברסיטת שנגחאי Jiao טונג. 1. הכנת החומרים השתמש ברצף MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK של MOG35-55 כדי להשיג את הפפטיד lyophilized ממקורות מסחריים. ודא כי טוהר הפפטיד הוא >95%. הכן 10 מ”ג/מ”ל MOG פתרון מניות בתמיסת מלח פו?…

Representative Results

לאחר חיסון של עכברים C57BL/6, כל העכברים נשקלו, נבדקו, ותודרגו מדי יום עבור סימנים נוירולוגיים. הקורס הקליני המייצג של EAE צריך לגרום עקומת מחלה כפי שמוצג איור 2A ושינוי משקל הגוף בעכבר כפי שמוצג איור 2B. C57BL/6 עכברים מחוסנים עם MOG35-55 בדרך כלל התחיל לפתח תסמיני מחלה ס?…

Discussion

מחקר זה מציג פרוטוקול כדי לגרום ולפקח EAE באמצעות MOG35-55 בעכברים C57BL/6, אשר נחשבים מודל בעלי חיים ניסיוני נוירואימונולוגי טיפוסי של MS. EAE יכול להיות מושרה משתנה זנים עכברים או סוג של חלבון המשמש אינדוקציה על פי מטרת המחקר. לדוגמה, באמצעות PLP139-151 פפטיד בעכברים SJL יכול לגרום קורס מחלת EAE relapsing remitting ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין מענק (31570921 ל ZJ, 81571533 לLS), הוועדה העירונית של שנגחאי לבריאות, ותכנון משפחה (201540206 ל ZJ), Ruijin בית החולים צפון מענק מחקר (2017ZX01 ל ZJ).

Materials

Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 eBioscience 56-0454-82
Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block BioLegend 101302
APC anti-mouse IFN-g eBioscience 17-7311-82
BD LSRFortessa X-20 BD
Dounce homogenizer Wheaton 353107542
eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) eBioscience 00-4975-03
eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set eBioscience 88-8824-00
FITC anti-mouse CD3 BioLegend 100203
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400605
Freund's Adjuvant Complete (CFA) Sigma-Aldrich F5881
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience eBioscience 56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra Difco Laboratories 231141
PE anti-mouse IL-17A eBioscience 12-7177-81
PE/Cy7 anti-mouse CD4 BioLegend 100422
PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400617
Percoll GE 17-0891-01
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b BioLegend 101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400631
pertussis toxin (PTX) Sigma-Aldrich P-2980
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience eBioscience 17-4301-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience eBioscience 12-4321-80
Rat MOG35–55 peptides Biosynth International MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK

References

  1. Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
  2. Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
  3. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
  4. Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
  5. Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
  6. Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
  7. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  8. Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
  9. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
  10. McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
  11. Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
  12. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
  13. Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
  14. Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
  15. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
  16. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).
  17. Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).

Play Video

Cite This Article
Ji, Z., Zhou, C., Niu, H., Wang, J., Shen, L. Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (165), e61050, doi:10.3791/61050 (2020).

View Video