Flow cytometrisk analyse af lymfocyt infiltration i centralnervesystemet under eksperimentel autoimmun encephalomyelitis
Summary
Dette manuskript præsenterer en protokol til at fremkalde aktiv eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) i mus. En metode til isolering og karakterisering af de infiltrerede lymfocytter i centralnervesystemet (CNS) præsenteres også for at vise, hvordan lymfocytter er involveret i udviklingen af CNS autoimmun sygdom.
Abstract
Multipel sklerose (MS) er en autoimmun sygdom i centralnervesystemet (CNS) forårsaget af kombinationen af miljømæssige faktorer og modtagelig genetisk baggrund. Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er en typisk sygdomsmodel af MS, der i vid udstrækning anvendes til undersøgelse af patogenese, hvor T-lymfocytter, der er specifikke for myelinantigener, indleder en inflammatorisk reaktion i CNS. Det er meget vigtigt at vurdere, hvordan lymfocytter i CNS regulere udviklingen af sygdom. Men, tilgang til måling af mængden og kvaliteten af infiltrerede lymfocytter i CNS er meget begrænset på grund af vanskelighederne med at isolere og detektere infiltrerede lymfocytter fra hjernen. Dette manuskript præsenterer en protokol for, der er nyttig for isolering, identifikation og karakterisering af infiltrerede lymfocytter fra CNS og vil være nyttigt for vores forståelse af, hvordan lymfocytter er involveret i udviklingen af CNS autoimmune sygdom.
Introduction
Som en kronisk demyeliniserende sygdom i CNS, MS påvirker omkring 2,5 millioner mennesker på verdensplan og mangler helbredende behandlinger1. Det betragtes også som en autoimmun sygdom, hvor myelin antigen specifikke T lymfocytter indlede en inflammatorisk reaktion og føre til demyelinisering og axonal skade i CNS2. Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er blevet udbredt til at undersøge patogene mekanismer af MS som en klassisk autoimmun demyelinær sygdom model i CNS3. Der er to måder at fremkalde EAE: den ene er at fremkalde EAE aktivt ved at immunisere dyr med myelin komponenter, en anden er adoptivoverførsel ved at overføre encephalitogenic T-celler i receptor2,,4,5. Modtageligheden for EAE er forskellige i forskellige dyrestammer6. I C57BL/6 mus, myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG) 35-55 udfordring inducerer en monofasisk sygdom med omfattende demyelinisering og betændelse i CNS, som ofte anvendes i forsøg med gen-målrettede mus7.
Generering af myelinspecifikke reaktive T-celler er nødvendig for forekomst og udvikling af sygdom i EAE og er et immunologisk tegn på både EAE og MS. Aktiverede autoreaktive T-lymfocytter krydser blod-hjernebarrieren (BBB) i den sunde CNS og initierer EAE-sygdommen. Når MOG 35-55 Ag er stødt på, disse T lymfocytter fremkalde betændelse og rekruttering af effektor celler i CNS, resulterer i demyelinisering og axon destruktion8,9. I EAE-modellen er der rigelige beviser for, at neuroantigenspecifikke CD4+ T-celler kan initiere og opretholde neuroinflammation og patologi3,10. Afhængigt af de vigtigste cytokiner, der produceres, er CD4+ T-lymfocytter blevet klassificeret i forskellige delmængder: Th1 (karakteriseret ved produktion af interferon-γ), Th2 (karakteriseret ved produktion af interleukin 4) og Th17 (karakteriseret ved produktion af interleukin 17). Det menes, at aktivering af Th1 og Th17 celler bidrage til induktion, vedligeholdelse og regulering af inflammatorisk demyelinisering i EAE og MS ved at udskille effektor cytokiner IFN-γ og IL-17, som er i stand til at aktivere makrofager og rekruttere neutrofiler til de steder inflammatoriske at fremskynde læsioner11.
Da autoreaktive T-celler krydser BBB i CNS og fremkalder sygdomsudvikling i MS og EAE, er det meget vigtigt at analysere T-celler i CNS. Der er dog meget få etablerede protokoller for isolering af lymfocytter fra CNS12. Derfor blev der udviklet en metode, der er optimeret til isolering af mononukleare celler fra hjernen og analyse af T-lymfocytter med markører CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g og IL-17 for flowcytometri. Metoden bruger MOG35-55 adjuvans Mycobacterium tuberkulose H37 Ra og Pertussis Toksin Working Solution (PTX) til at fremkalde en aktiv immuniseringsmodel af EAE i mus. Derefter anvendes mekaniske adskillelses- og tæthedsgradientueringsmetoder til isolering af CNS mononukleare celler. Endelig bruges en optimeret flow cytometri gating strategi til at identificere T lymfocytter og delmængder fra hjernen ved farvning flere markører.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne undersøgelse præsenterer en protokol til at fremkalde og overvåge EAE ved hjælp af MOG35-55 i C57BL/6 mus, som betragtes som en typisk neuroimmunologisk eksperimentel dyremodel af MS. EAE kan induceres varierende mus stammer eller den type protein, der anvendes til induktion i henhold til formålet med undersøgelsen. For eksempel, ved hjælp af PLP139-151 peptid i SJL mus kan fremkalde en recidiveløsning-remitterende EAE sygdom kursus, der er særligt velegnet til vurdering af terapeutiske virkninger på tilb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af National Natural Science Foundation of China tilskud (31570921 til ZJ, 81571533 til LS), Shanghai Municipal Commission of Health, and Family Planning (201540206 til ZJ), Ruijin Hospital North forskningstilskud (2017ZX01 til ZJ).
Materials
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
References
- Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
- Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
- Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
- Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
- Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
- McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
- Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
- Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
- Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
- Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).
- Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).
