Method Article

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

DOI:

10.3791/61050

⸱

November 17th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine Research Center, Ruijin Hospital North, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Microbiology and Immunology, Tongji University School of Medicine, 3Shanghai Institute of Immunology, Shanghai Key Laboratory for Tumor Microenvironment and Inflammation, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고는 마우스에서 활성 실험자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 중추신경계(CNS)에서 침투된 림프구의 분리 및 특성화 방법도 림프구가 CNS 자가면역 질환의 발병에 어떻게 관여하는지 보여주기 위해 제시된다.

Abstract

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다발성 경화증 (MS)은 환경 적 요인과 취약한 유전 배경의 조합으로 인한 중추 신경계 (CNS)의 자가 면역 질환입니다. 실험적인 자가면역 뇌척수염(EAE)은 MYelin 항원특이적 T 림프구가 CNS에서 염증 반응을 개시하는 병원발생을 조사하는 데 널리 사용되는 MS의 전형적인 질병 모델이다. CNS의 림프구가 질병의 발달을 어떻게 조절하는지 평가하는 것이 매우 중요합니다. 그러나, CNS에서 침투된 림프구의 양과 품질을 측정하는 접근법은 뇌에서 침투된 림프구를 분리하고 검출하는 데 어려움이 있기 때문에 매우 제한적이다. 이 원고는 CNS에서 침투된 림프구의 격리, 식별 및 특성화에 유용하며 림프구가 CNS 자가 면역 질환의 개발에 어떻게 관여하는지에 대한 우리의 이해에 도움이 될 것입니다.

Introduction

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CNS의 만성 탈근질환으로서 MS는 전 세계적으로 약 250만 명에게 영향을 미치고 치료 치료1이부족하다. 또한 골수린 항원 특이적 T 림프구가 염증 반응을 시작하고 CNS2에서탈량 및 축산 손상을 유도하는 자가 면역 질환으로 간주됩니다. 실험적인 자가면역 뇌척수염(EAE)은 CNS3에서고전적인 자가면역 탈생 질환 모델로서 MS의 병원성 메커니즘을 조사하는 데 널리 사용되고 있다. EAE를 유도하는 방법에는 두 가지가 있습니다: 하나는 골린 성분으로 동물을 예방 접종함으로써 EAE를 적극적으로 유도하는 것입니다, 또 다른 하나는 뇌성 T 세포를 수용체2,,4,,5로이송하여 입양 전달이다. EAE에 대한 감수성은 다른 동물 균주6에서다릅니다. C57BL/6 마우스에서, myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG) 35-55 도전은 유전자 표적 마우스를 가진 실험에서 빈번하게 이용되는 CNS에 있는 광대한 탈근 및 염증을 가진 단면질환을 유도합니....

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Protocol

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여기에 설명된 모든 방법은 상하이 자오퉁 대학교 기초의학대학의 동물위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 재료의 준비

  1. MOG35-55의 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK 서열을 사용하여 상업적 인 공급원으로부터 리오필화 펩티드를 얻습니다. 펩티드의 순도가 >95%인지 확인합니다. 인산염 완충식식염(PBS)에 10 mg/mL MOG 스톡 용액을 준비하고 -20°C에 보관하십시오.
  2. M. 결핵 H37 Ra의 4 mg/mL 스톡 솔루션을 완전 프룬트(CFA)의 25mL에 M. 결핵 H37 Ra 100 mg 튜브를 넣고 믹싱을 준비합니다. 재고 용액을 -20 °C에 보관하십시오.
  3. PBS의 50mL에 PTX의 50 μg를 추가하여 1 ng/μL 백합 소독 작업 솔루션(PTX)을 준비하십시오. 작업 용액을 -20°C에 저장합니다.
  4. 모든 항체(즉, FITC 항마우스 CD3, PE/Cy7 항마우스 CD4, PerCP/Cy5.5 항마우스 CD11b, 알렉사 플루오르700 항마우스 CD45.2, PE 항마우스 IL-17A 및 APC 항마우스 IFN-γ)를 저장합니다.
  5. PBS의 500mL에 2mM 에틸렌 디아민 테트라아세틱산(EDTA)과 1%....

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Results

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C57BL/6 마우스의 예방 접종 후, 모든 마우스는 신경 징후를 위해 매일 계량, 검사 및 등급이 매겨졌습니다. EAE의 대표적인 임상 과정은 도 2B에제시된 바와 같이 도 2A에 제시된 질병 곡선과 마우스내 체중의 변화를 초래한다. MOG35-55로 예방접종된 C57BL/6 마우스는 보통 10~12일 경에 질병 증상을 일으키기 시작했고, 활성 예방접종 후 15~21일 경에 질병의 피크를 달성하였다(그림2A). 체중 변화는 EAE 모델에서 귀중한 지표였습니다. 질병의 개시 의 앞에, 면역한 마우스의 체중은 점차적으로 증가한 다음, 전형적으로 증가하는 질병 현상에 상관관계를 감소시켰습니다. EAE의 절정에, 마우스는 또한 가장 낮은 체중을 보였다(그림 2B). 그런 다음 임상 증상이 감소함에 따라 체중이 약간 회복되었.......

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Discussion

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본 연구는 C57BL/6 마우스에서 MOG35-55를 사용하여 EAE를 유도하고 모니터링하는 프로토콜을 제시하며, 이는 EAE MS의 전형적인 신경면역 실험 동물 모델로 간주되는 것으로 간주되어 연구의 목적에 따라 유도에 사용되는 마우스 균주 또는 단백질의 종류를 변화시킬 수 있다. 예를 들어, SJL 마우스에서 PLP139-151 펩티드를 사용하면 재발에 대한 치료 효과를 평가하기에 특히 적합한 재발-방출 EAE 질병 과정을 유도할 수있다. 여기에 설명된 실험 절차는 다른 EAE 프로토콜7에도적용할 수 있습니다. 이 모델에서, C57BL/6 마우스는 MOG35-55 펩티드로 면역화되고 단면질환을 개발한다. 5점 득점 시스템은 EAE의 심각도를 평가하는 데 사용됩니다. 0-3점 또는 0-10점에 이르는 여러 득점 시스템이 질병 심각도7,,16,

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Disclosures

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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국 국립 자연과학 재단(31570921 ~ZJ, 81571533 ~ LS), 상하이 시 보건위원회 및 가족 계획 (201540206 ~ ZJ), 루이진 병원 노스 연구 보조금 (2017ZX01 )

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor700 안티 마우스 CD45.2eBioscience56-0454-82
안티 마우스 CD16/CD32 Fc 블록BioLegend101302
APC 안티 마우스 IFN-geBioscience17-7311-82
BD LSRFortessa X-20BD
Dounce 균질화 휘튼353107542
eBioscience 세포 자극 칵테일 (단백질 수송 억제제 포함) (500X)eBioscience00-4975-03
eBioscience 세포 내 고정 및 투과화 완충액 세트eBioscience88-8824-00
FITC 안티-마우스 CD3BioLegend100203
FITC 랫 IgG2b, κ Isotype Ctrl 항체BioLegend400605
Freund's Adjuvant Complete (CFA)Sigma-AldrichF5881
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscienceeBioscience56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 RaDifco Laboratories231141
PE anti-mouse IL-17AeBioscience12-7177-81
PE/Cy7 안티-마우스 CD4BioLegend100422
PE/Cy7 쥐 IgG2b, κ Isotype Ctrl 항체BioLegend400617
PercollGE17-0891-01
PerCP/Cy5.5 안티-마우스 CD11bBioLegend101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl 항체BioLegend400631
백일해 독소 (PTX)Sigma-AldrichP-2980
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscienceeBioscience17-4301-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscienceeBioscience12-4321-80
Rat MOG35– 55 펩타이드Biosynth InternationalMEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
  2. Gold, R., Linington, C., Lassmann, H.

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Flow CytometryLymphocyte InfiltrationCentral Nervous SystemExperimental Autoimmune EncephalomyelitisCell IsolationDensity Gradient CentrifugationAntibody StainingIntracellular Cytokine AnalysisMOG 35 55C57BL 6 Mice

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