Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En plattform för vätedeuteriumutbyte av masspektrometri (HDX-MS) för undersökning av peptidbiosyntetiska enzymer

Published: May 4, 2020 doi: 10.3791/61053
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, McGill University

Summary

Lanthipeptid synthetases katalyserar multistepreaktioner under biosyntesen av peptid naturliga produkter. Här beskriver vi ett kontinuerligt, bottom-up, väte-deuterium utbyte masspektrometri (HDX-MS) arbetsflöde som kan användas för att studera konformationsdynamiken hos lanthipeptid synthetases, liksom andra liknande enzymer som är involverade i peptid naturliga produkt biosyntes.

Abstract

Väte-deuterium utbyte masspektrometri (HDX-MS) är en kraftfull metod för biofysisk karakterisering av enzym conformational förändringar och enzym-substrat interaktioner. Bland dess många fördelar konsumerar HDX-MS endast små mängder material, kan utföras under nära inhemska förhållanden utan behov av enzym / substratmärkning och kan ge rumsligt löst information om enzymkonformationsdynamik−även för stora enzymer och multiproteinkomplex. Metoden initieras genom utspädning av enzymet av intresse till buffert beredd i D2O. Detta utlöser utbytet av protium i peptidbindning mitt i (N-H) med deuterium (N-D). Vid önskade utbytespunkter släcks reaktions alikvoter, enzymet proteolyseras i peptider, peptiderna separeras av ultraprestanda flytande kromatografi (UPLC) och förändringen i massan av varje peptid (på grund av utbyte av väte mot deuterium) registreras av MS. Mängden deuteriumupptag vid varje peptid är starkt beroende av den lokala vätebindningsmiljön för den peptiden. Peptider som förekommer i mycket dynamiska regioner i enzymutbytesdeuterium mycket snabbt, medan peptider som härrör från välbeställda regioner utbytes mycket långsammare. På detta sätt rapporterar HDX-hastigheten om lokal enzymkonformationsdynamik. Perturbations till deuteriumupptag jämnar i närvaroen av olika ligands kan därefter användas för att kartlägga ligand bindningplatser, identifiera allosteric knyter kontakt, och att förstå rollen av conformational dynamik i enzym fungerar. Här illustrerar vi hur vi har använt HDX-MS för att bättre förstå biosyntesen av en typ av peptid naturliga produkter som kallas lanthipeptider. Lanthipeptider är genetiskt kodade peptider som efter translationellt modifieras av stora, multifunktionella, konformationellt dynamiska enzymer som är svåra att studera med traditionella strukturbiologiska metoder. HDX-MS ger en idealisk och anpassningsbar plattform för att undersöka de mekanistiska egenskaperna hos dessa typer av enzymer.

Introduction

Proteiner är strukturellt dynamiska molekyler som provar olika konformationer på tidsskalor som sträcker sig från femtosekrerade bindningsvibrationer till omorganiseringar av hela proteindomäner som kan uppstå under många sekunder1. Dessa conformational fluktuationer är ofta kritiska aspekter av enzym/protein funktion. Till exempel är konformationsförändringar som induceras av ligandbindning ofta kritiskt viktiga för att modulera enzymfunktionen, antingen genom att organisera aktiva rester som behövs för katalys, definiera substratbindningsplatser i sekventiella kinetiska mekanismer, skydda reaktiva intermediärer från miljön eller genom att modulera enzymfunktionen via allosteriska nätverk. Nyligen genomförda studier har också visat att konformationsdynamik kan bevaras genom hela evolutionen och att förändringar i bevarade molekylära rörelser kan korreleras med förändringar i substratspecifikitet och uppkomsten av nya enzymfunktioner2,3.

Under de senaste åren har vätedeuteriumutbyte masspektrometri (HDX-MS) snabbt dykt upp som en kraftfull teknik för att undersöka hur proteinkonformationslandskap reagerar på stör som ligandbindning eller mutagena4,5,6,7. I ett typiskt HDX-MS-experiment (figur 1) placeras ett protein av intresse i en buffert som bereds i D2O, vilket utlöser ersättning av lösningsmedelsbytbara protoner med deuteria. Utbyteskursen för peptidbindningarna mitt i peptidbindningarna beror starkt på pH, den lokala aminosyrasekvensen och på den lokala strukturella miljön iamidet 8. Amides som är engagerade i vätebindningsinteraktioner (som de som finns i α-helices och β-ark) utbyter långsammare än mitt i ostrukturerade områden av proteinet som utsätts för bulklösningsmedel. Således är omfattningen av deuteriumupptag en återspegling av enzymets struktur. Enzymer som är konformationellt dynamiska, eller som genomgår strukturella övergångar på ligandbindning, förväntas ge ett mätbart HDX-svar.

Den mekanistiska grunden för den långsamma växelkursen för ett strukturerat amid visas i figur 25,8,9. För att genomgå HDX måste den strukturerade regionen först tillfälligt ta prov på en utfälld konformation, så att lösningsmedelsmolekylerna som katalyserar HDX-utbyte via en specifik syra/baskemisk mekanism har tillgång till det utbytbara amidet. I slutändan bestämmer de relativa magnituderna för den kemiskaväxelkursen (kchem)och viknings- och omviktningshastigheterna(köppna och knära)den HDX-kurs som mäts iexperimentet 5,8. Från denna enkla kinetiska modell är det uppenbart att omfattningen av deuteriumupptaget kommer att återspegla den underliggande konformationsdynamiken (enligt definitionen av köppen och knära). De flesta HDX-MS-experiment utförs i ett bottom-up arbetsflöde där, efter utbytesreaktionen, proteinet av intresse smälts in i peptider och deuteriumupptaget av varje peptid mäts som en ökning av massa7. På detta sätt tillåter HDX-MS att perturbationer till enzymkonformationsdynamik kartläggs på den lokala rumsliga skalan av peptider, vilket gör det möjligt för forskaren att bedöma hur stören förändrar dynamiken i olika regioner av enzymet av intresse.

Fördelarna med HDX-MS-metoden för att belysa proteinstrukturdynamiken är många. För det första kan metoden utföras med små mängder inhemskt protein eller på proteinkomplex i system med kvartärstruktur10. Det är inte ens nödvändigt att enzympreparatet som används i analysen är mycketrenat 11,12, så länge det nedifrån och upp HDX-MS-arbetsflödet ger ett tillräckligt antal säkert identifierade peptider som täcker proteinsekvensen av intresse. Dessutom kan HDX-MS ge information om konformationsdynamik under nästan inhemska förhållanden utan behov av platsspecifik proteinmärkning som skulle användas i fluorescensstudiermed en molekyl 13, och det finns ingen storleksgräns för proteinet eller proteinkomplexet som kan undersökas (vilket gör tillvägagångssätt som kärnmagnetisk resonans [NMR] spektroskopi utmanande)7,14. Slutligen kan tidsbefriade HDX-MS-metoder användas för att studera inneboende oordnade proteiner, som är svåra att studera med röntgenkristallografi15,16,17,18. Den huvudsakliga begränsningen av HDX-MS är att data är av låg strukturell upplösning. HDX-MS-data är användbara för att peka på var konformationsdynamiken förändras och för att avslöja kopplade konformationsförändringar, men de ger inte ofta mycket insikt i den exakta molekylära mekanismen som driver den observerade förändringen. De senaste framstegen i kombinationen av elektronfångstdisociationsmetoder med protein HDX-MS-data har visat löfte om att kartlägga utbytesplatser till enskilda aminosyrarester19, men uppföljning av biokemiska och strukturella studier behövs fortfarande ofta för att ge klarhet till strukturella modeller som vidarebefordras av HDX-MS-data.

Nedan presenteras ett detaljerat protokoll för utveckling av en HDX-MS-analys20. De provberedningsprotokoll som presenteras nedan bör i allmänhet tillämpas på alla proteiner som uppvisar god löslighet i vattenhaltiga buffertar. Mer specialiserade provberedningsmetoder och HDX-MS-arbetsflöden finns tillgängliga för proteiner än vad som behöver analyseras i närvaro av tvättmedel eller fosfolipider21,22,23,24. Instrumentella inställningar för HDX-MS datainsamling beskrivs för en högupplöst fyrdubbel flygtidsmasspektrometer i kombination med flytande kromatografisystem. Data om liknande komplexitet och upplösning kan samlas in på något av ett antal kommersiellt tillgängliga vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) system. Viktiga aspekter av databehandlingen med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt programvarupaket tillhandahålls också. Vi presenterar också riktlinjer för datainsamling och analys som överensstämmer med rekommendationerna från den bredare HDX-MS-communityn12. Det beskrivna protokollet används för att studera de dynamiska strukturella egenskaperna hos HalM2, en lanthipeptidsyntetas som katalyserar multistepsmognaden hos en antimikrobiell peptid naturlig produkt20. Vi illustrerar hur HDX-MS kan användas för att avslöja substratbindningsplatser och allosteriska egenskaper som har gäckat tidigare karakterisering. Flera andra protokoll om protein HDX-MS har publicerats under de senaste åren25,26. Tillsammans med det nuvarande arbetet bör dessa tidigare bidrag ge läsaren viss flexibilitet i experimentell design.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av avutererade reagenser och enzymlagerlösningar

  1. Förbered reagenser som behövs för HDX-reaktionerna (inklusive eventuella buffertar, salter, substrat, ligands, etc.) som 100−200x koncentrerade stamlösningar i D2O (99,9% atomfraktion D). Förbered minst 50 ml buffertlagerlösning.
    OBS: För karakterisering av HalM2 utarbetades följande lösningar: 500 mM MgCl2,100 mM tris (2-carboxyetyl)fosfin (TCEP), 750 mM ATP (i HEPES-buffert), 800 mM HEPES pD 7,1, 500 μM HalA2 och 500 mM AMPPNP.
  2. Frys och frys lyofilisera lagerlösningarna till torrhet.
  3. Lös upp i D2O igen och upprepa lyofiliseringscykeln minst en extra gång för att ersätta så många av de utbytbara protonerna med deuteroner som möjligt.
  4. Justera pD för det avargade HEPES-buffertlagret till önskat värde med koncentrerad NaOD/DCl, med tanke på följande förhållande27:
    Equation 1
    OBS: Amide HDX-hastigheten är starkt beroende av lösningens pL (pL = pH eller pD)5. Olika partier av buffertlagerlösningar måste förberedas, lagras och användas på ett identiskt sätt för att undvika liten pL-drift mellan experimenten.
  5. Beräkna mängden av varje reagens som behövs för en 300 μL HDX-analys och lagra som engångs alikvoter vid -80 °C.
  6. Bered en koncentrerad enzymlagerlösning (~100−200 μM) i protiated enzymlagringsbuffert med hjälp av ett centrifugalfilter (Table of Materials) eller motsvarande anordning.
    OBS: Den exakta bufferten och centrifugalfiltrets molekylviktsavskärning beror på proteinet/enzymet av intresse. HalM2 lagras i 50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM KCl och 10% glycerol. 10 kDa filter användes för att förbereda det koncentrerade enzymet.
  7. Aliquot enzymet i engångsportioner och lagra vid -80 °C.
    OBS: Detta kan vara en stopppunkt. Alla lagerlösningar som beskrivs i avsnitt 1 kan förberedas före HDX-reaktionerna. Om de lagras vid -80 °C kommer de flesta enzymer/avuterated stamlösningar att vara stabila i många månader.

2. Kalibrering av HDX-släckvolymen

  1. Förbered en 300 μL HDX-reaktion i D2O med hjälp av de avutererade reagenserna och de koncentrerade enzymlagren som framställs i avsnitt 1.
    1. Använd en slutlig enzymkoncentration på 1−5 μM.
    2. Använd en slutlig avuterated HEPES buffertkoncentration på minst 50−100 mM.
    3. Se till att koncentrationerna av andra komponenter är tillräckliga för att bibehålla önskad enzymaktivitet/funktion.
  2. Förbered 1 L HDX-släcklösning (100 mM fosfat, 0,8 M guanidin-HCl, pH 1,9). Frys och förvara i både 50 ml portioner (för långtidslager) och 1 ml portioner (för engångs alikvoter).
    OBS: Den exakta sammansättningen av släckbufferten beror på enzymet som används i proteolyssteget i hdx-MS-arbetsflödet nedifrån och upp (steg 3.3.3). Den släpbuffert som ges här är kompatibel med pepsin, den vanligaste proteasen för HDX-MS. Om en annan proteas används, kontrollera med proteaseleverantören för att säkerställa buffertkompatibilitet.
  3. Kalibrera volymen av släckbufferten som behövs för att justera det slutliga pL:t för den släckta HDX-reaktionsblandningen till ett pH-mätaravläsningsvärde på 2,3.
    OBS: Peptidens H/D-växelkurs för lösningsmedel mitt i N-H-bindningen är en pH-beroende process som är föremål för både syra- och baskatalys. Minimiväxelkursen sker till ett värde av pH 2,5 (pH-mätaravläsning = 2,3 för en blandning på 50:50 H2O:D2O). Således kommer ett slutligt pL-värde nära 2,5 att minimera vätebackutbytet som sker under bottom-up LC-MS-analysen, vilket bevarar deuteriumetiketten i peptiderna.
    1. Blanda 50 μL av HDX-reaktionsblandningen från steg 2.1 med 50 μL kylbuffert och mät pL för den släckta blandningen med en mikrotoplektrod.
    2. Öka volymen av släcklösningen efter behov för att justera den slutliga pH-mätaravläsningen till ett värde av 2,3.
    3. När lämplig släpvolym har fastställts upprepar du släckningsprocessen flera gånger med färska 50 μL alikvoter från HDX-reaktionen (steg 2.1) för att säkerställa att ett konsekvent slutligt pL uppnås vid tillsats av en fast mängd släckbuffert.

3. Förberedelse av referensprover och optimering av LC-MS-arbetsflödet nedifrån och upp

  1. Förbered odeuterade referensprover för protein av intresse för tre exemplar i 0,5 ml-rör. Se till att de slutliga reaktionsblandningsförhållandena är identiska med dem som används i de autentiska HDX-reaktionerna (steg 2.1), förutom att reaktionerna bereds i H2O med hjälp av reagenslagerlösningar som också bereds i H2O.
  2. Täck ut proverna som i steg 2.3 genom att tillsätta lämplig volym av släckbuffert för att justera det slutliga pH-värdevärdet till 2.5. Blixten fryser proverna i flytande kväve och förvaras vid -80 °C tills de är klara för analys.
  3. Analysera de protierade enzymreferensproverna med hjälp av ett nedifrån och upp LC-MS-arbetsflöde.
    OBS: Innan du utför dessa steg bör LC-MS-systemet som ska användas för datainsamling vara korrekt kalibrerat och klart för användning. Tidpunkten och temperaturen för alla steg i LC-MS-arbetsflödet nedifrån och upp måste kontrolleras noggrant för att minimera skillnaderna i utbyte bakåt mellan proverna. Med den MS-instrumentering som används i detta protokoll (Tabell över material Och Stödjande information), kan de flesta stegen styras genom instrumentprogramvaran. För att säkerställa insamlingen av exakta replikat rekommenderas att automatisera så många steg i arbetsflödet som möjligt.
    1. Avlägsna ett individuellt enzymreferensprov (framställt enligt steg 3.2) från frysen och tina vid 37 °C i 1 minut i ett vattenbad.
    2. Vid exakt 2 min efter att provet avlägsnats från frysen och upptining injicerar du en 40 μL-del av det släckta referensprovet i en ultrafunktionell vätskekromatografikolonn (2,1 x 30 mm, 300 Å, 5 μM) som innehåller en stationär fas som är funktionell med pepsin (en syrastabil proteas).
    3. Smält provet med en flödeshastighet på 100 μL/min i 3 min vid 15 °C med 0,1 % myrsyra i H2O (pH = 2,5) som lösningsmedel.
    4. Samla de septiska peptiderna när de eluerar från pepsinkolonnen på en C18-fälla som hålls vid 0,4 °C för att minimera utbytet tillbaka.
    5. Skicka de avsaltade septiska peptiderna från fällan till en C18-analyskolonn (1 mm x 100 mm, 1,7 μM, 130 Å) som hålls och drivs vid 0,4 °C för separation av septiska peptider.
      OBS: Steg 3.3.3−3.3.5 kan automatiseras av vissa LC-MS-system som används för HDX-MS-datainsamling. Alternativt kan dessa steg utföras självständigt, med tanke på att tidpunkten och temperaturen för varje steg måste kontrolleras noggrant för att uppnå ett konsekvent lågt ryggutbyte.
    6. Eluera C18-kolonnen med ett acetonitrilt/vatten/0,1% myrsyralösningssystem. Optimera LC-lutningen för det protein som är av intresse för att maximera separationen av och bevara deuteriumetiketten i de septiska peptiderna.
      OBS: Gradient elution detaljer finns i stödjande information.
    7. Underkasta den septiska sammandrag till elektrosprayjonisering (ESI) masspektrometri.
      OBS: De källförhållanden som anges i stödinformationen kommer att ge tillräcklig jonisering för de flesta septiska peptider.
      1. När den har joniserats i MS-instrumentet, utför en separation av gasfasjonrörlighet med kväve som buffertgas för att förbättra metodens toppkapacitet.
      2. Efter jonrörlighetsseparationen, subjekt peptidprekursorjoner till ett MSE-arbetsflöde som involverar alternerande cykler av låg kollisionsenergi (4 V) och hög kollisionsenergi (21−40 V).
        OBS: De alternerande energisystemen med låga och höga kollisioner möjliggör insamling av MS-data (låg kollisionsenergi) samtidigt med MSMS-data (hög kollisionsenergi). Detta möjliggör i sin tur tidskorrelation mellan prekursorjoner och deras respektive fragmentjoner. Denna korrelation är nödvändig för säker peptididentifiering som beskrivs i avsnitt 4.
      3. Detektera peptidprekursorn och fragmentjonerna med hjälp av en massanalysator med en lösningskraft på minst 20 000.
      4. Samtidigt med datainsamlingen, förvärva MS-data för en extern standard för [Glu-1]-fibrinopeptidE B (GluFib).
        MS-arbetsflödet som beskrivs i steg 3.3.7 kallas msE-protokoll. Kompletta instrumentella inställningar för ett MSE-protokoll som är lämpligt för HDX-MS nedifrån och upp finns i stödinformationen.
    8. Utvärdera kvaliteten på LC-MS-data.
      OBS: Med hjälp av det protokoll som beskrivs ovan och de instrumentella inställningarna i stödinformationenbör referensproverna producera ett totalt jonkromatogram med en maximal signalintensitet på cirka 1 x 108. Det bör finnas många septiska peptider som eluerar mellan 3−9 min (Figur 3A−C).
    9. Injicera 40 μL tomma prover (0,1 % myrsyra i vatten) för att rengöra pepsin- och analys C18-kolonnerna.
      OBS: I allmänhet bör 2−3 ämnen vara tillräckliga.
    10. Upprepa steg 3.3.1−3.3.9 för vart och ett av referensproteinproverna.

4. Bearbetning av referensdata och definition av en peptidlista

  1. Analysera de råa MSE-data (steg 3.3.7) med hjälp av proteomikprogramvara (Table of Materials). Navigera till Bibliotek med hjälp av proteomikprogramvaran | Proteinsekvensdatabanker för att definiera proteindatabasen genom att importera aminosyrasekvensen av proteinet av intresse.
    OBS: Målet med detta steg är att söka i referens MS-data för septiska peptider som härrör från proteinet av intresse och att använda MSMS-data (förvärvade samtidigt med MS-data) för att validera eventuella förmodade peptididentifieringar.
  2. Ge ett namn till proteinsekvensen av intresse. Importera proteinsekvensen (i FASTA-format). Programvaran kommer att utföra en in silico matsmältning av databasproteinet för att generera en lista över peptider som kommer att användas för att söka LC-MS data.
  3. Definiera bearbetningsparametrarna (som finns under biblioteksmenyn). Välj Electrospray MSE som datainsamlingstyp. I fältet Låsmassa för laddning 2 anger du 785.8426 för m/z för 2+ jonen av [Glu-1]-fibrinopeptidE B (GluFib) och klicka på finish.
  4. Definiera arbetsflödesparametrarna (som finns under biblioteksmenyn).
    1. Välj Electrospray MSE för söktypen. Under arbetsflödes-| Rubriken Databassökningsfråga väljer du databasproteinet som skapas i steg 4.2 i fältet Databank.
    2. Ändra primärt smältreagens till ospecificerat och rensa fältet Fast modifierareret genom att hålla ned Ctrl-knappen medan du klickar på Carbamidomethyl C.
  5. Ange utdatakatalogen genom att navigera till alternativ | automatiseringsinställning | Identitet E. Markera rutorna för Apex 3D och Peptide 3D Output and Ion Accounting Output och ange önskad katalog.
  6. Bearbeta referensprovdata.
    1. På den vänstra verktygsfältet på proteomics plattformsarbetsytan, skapa en ny platta genom att högerklicka på Microtiter Plate. Markera tre brunnar i mikrotiterplattan (en för varje referensprov som samlas in i avsnitt 3). Vänsterklicka i en brunn, håll och dra till tre brunnar.
    2. Högerklicka och välj lägg till rådata. I fönstret som visas navigerar du till katalogen som innehåller de tre referensfilerna från avsnitt 3 och markerar dem samtidigt.
    3. Klicka på nästa och välj de bearbetningsparametrar som definieras i steg 4.3. Klicka på nästa och välj de arbetsflödesparametrar som definieras i steg 4.4. Klicka sedan på finish.
  7. När rådata, bearbetningsparametrar och arbetsflödesparametrar har tilldelats varje brunn på plattan kommer brunnarna att se blå ut. Markera brunnarna, högerklicka och välj bearbeta senaste rådata. Klicka i det högra nedre hörnet av fönstret för att spåra bearbetningen av data. När meddelandet Inget jobb som ska köras visas är bearbetningen helt klar.
  8. När databehandlingen är klar blir brunnarna i plattan gröna. Högerklicka på brunnarna och välj visa arbetsflödesresultat. Ett separat fönster öppnas för varje referensdatafil.
  9. Inspektera data för att säkerställa att majoriteten av MS-signalerna i referensprovdata framgångsrikt mappades till peptider som förutspåtts från in-silico-matsmältningen av proteinet av intresse. Matchade peptider kommer att färgas blått i utgångsspektrumet (Figur 4). Dubbelklicka på OK-filtret och kontrollera att procenttäckningen är större än 99%.
    OBS: Vid bearbetning sparas datautdata automatiskt medfiltillägget (raw_data_file_name_IA_final_peptide) i den katalog som anges i steg 4.5.
  10. Importera proteomikprogramvaran till HDX-bearbetningsprogramvaran(Table of Materials)för ytterligare tröskelvärden.
    1. Klicka på Data i det vänstra hörnet av HDX-bearbetningsprogramfönstret. Klicka på importera PLGS-resultat och klicka på lägg till-ikonen. Välj de bearbetade datafilerna från steg 4.9 genom att navigera till lämplig katalog.
    2. Klicka på Nästa och ange följande parametrar: minsta på varandra följande joner ≥ 2, massfel = 5 sid/min och filtröskel = 3. Klicka på finish.
  11. När du är nöjd med tröskelvärdesparametrarna sparar du HDX-projektet. Alla HDX-data kommer att importeras till detta projekt för analys och visning.
    OBS: De utbytbara proverna som beskrivs i nästa avsnitt måste bearbetas med ett identiskt LC-MS-arbetsflöde. Innan du fortsätter med HDX-analyser (avsnitt 5), se därför till att provberedningen (avsnitt 2), nedifrån och upp LC-MS-arbetsflödet (avsnitt 3) och databehandlingsarbetsflödena (avsnitt 4) ger önskad reproducerbarhet och sekvenstäckning av målproteinet. Om någon av dessa processer behöver ändras för att förbättra täckningen, rekommenderas att återgå till steg 2.1, förbereda färska referensprover i tre exemplar och upprepa avsnitten 2−4 (samtidigt som nödvändiga justeringar av protokollet) görs för att säkerställa att varje peptid kan genereras och detekteras på ett reproducerbart sätt.

5. Utföra HDX-reaktioner

  1. Förbered arbetsytan för HDX-reaktioner.
    1. För-alikvotssläckningsbuffert till korrekt märkta 0,5 ml-rör. Förbered ett annat rör för varje tidpunkt, varje replikat och varje biokemiskt tillstånd som ska analyseras. Använd lämplig volym av släckbuffert från steg 2.2 som behövs för att justera den slutliga pH-mätaravläsningen av en 50 μL-del av HDX-reaktionen till ett värde av 2,3.
    2. Centrifugera kort de 0,5 ml badkaren för att överföra hela släckbufferten till botten av röret. Lägg rören på is.
    3. Fyll en liten Dewar med flytande kväve och håll dig intill arbetsytan.
  2. Förbered HDX-reaktionerna. Se till att det finns tillräcklig reaktionsvolym för att samla in önskat antal utbytespunkter (en 50 μL alikvot för varje önskad tidpunkt). Samla minst 4−5 tidspunkter över 3−4 storleksordningar i tidsskala (t.ex. släcka tider på 15 s, 60 s, 300 s [5 min], 1 800 s [30 min] och 14 400 s [4 h] ger tillräcklig täckning av utbytesdynamiken för de flesta enzymer).
    1. Blanda alla deutererade komponenterna (minus enzym) från steg 1.1 i D2O.
    2. För varje biokemiskt tillstånd som ska undersökas (fritt enzym, enzym + ligand, enzym + hämmare, etc.), förbered HDX-reaktioner i minst tre exemplar.
    3. Inkubera reaktionsblandningarna i ett temperaturkontrollerat vattenbad vid 25 °C i 10 minuter före tillsats av enzymet.
      OBS: Enzymet ska beredas som en koncentrerad stamlösning (~100−200 μM, steg 1.6) för att minimera tillsats av protium i HDX-analysen.
    4. När du tillsätter enzymet till en slutlig koncentration på 1−5 μM, starta timern. Blanda lösningen försiktigt och snabbt med en 200 μL-pipett för att säkerställa att enzymet fördelas jämnt i provet.
    5. Vid önskade utbytespunkter, ta bort 50 μL alikvoter från HDX-reaktionen och blanda snabbt och jämnt med den för alikvoterade, iskalla kölbufferten i ett 0,5 ml-rör.
      OBS: Blandningsvolymerna och blandningsproceduren måste vara så exakta och reproducerbara som möjligt för att säkerställa att önskat slutligt släp pL på 2.3 uppnås snabbt i alla prover. Att hålla släckerbufferten iskall hjälper till att minimera utbytet tillbaka vid denaturering av enzym.
    6. Omedelbart efter att HDX-provet har släckts, locket på röret och blixten fryser i flytande kväve.
    7. Fortsätt att samla in tidspunkter tills alla analyser är klara och överför sedan proverna till frysen -80 °C för förvaring.
      OBS: Detta kan vara en stopppunkt. Efter insamling av alla HDX-tidpunkter kan proverna lagras vid -80 °C tills de är klara för LC-MS-analys. Helst bör triplicate HDX-reaktioner utföras för alla biokemiska tillstånd av intresse samma dag. Åtminstone bör alla replikerade HDX-reaktioner för ett visst biokemiskt tillstånd köras parallellt samma dag.
  3. När du har samlat alla släckta HDX-tidspunkter kan du utsätta proverna för det optimerade nedifrån och upp LC-MS-arbetsflödet som utvecklats enligt beskrivningen i steg 3.3. Injicera HDX-prover i en randomiserad ordning med ett lämpligt antal ämnen mellan proverna för att säkerställa att eventuell peptid överföring är minimal.
    HDX-data behöver inte samlas in i MSE-läge. Energisegmentet med hög kollision (steg 3.3.7.2) bör därför tas bort från MS-arbetscykeln. Detta bör vara den enda ändringen som görs i arbetsflödet som beskrivs i steg 3.3.
  4. Utvärdera kvaliteten på HDX-data när de samlas in.
    1. Se till att kromatografiska toppar i det totala jonkromatogrammet i de odeputerade referensproverna visas samtidigt i de avutererade proverna (som i figur 3D−F).
    2. Se till att masspektra som summerats över specifika tidsintervall från referensprover och avutererade prover visar tecken på utmattning (dvs. en förskjutning av det isotopiska kuvertet för enskilda peptider till högre m/z-värden i de avutetrerade proverna [figur 6]).

6. Bearbetning av HDX-data

  1. Importera HDX-data till HDX-projektet som skapats i steg 4.11 genom att klicka på Data | MS-filer i det övre verktygsfältet.
    1. Klicka på New State och New Exposure efter behov för att definiera de biokemiska tillstånd (t.ex. fritt enzym, enzym + ligand, etc.) respektive deuteriumexponeringstider som är relevanta för analysen.
    2. Klicka på New Raw för att välja de HDX-datafiler som ska analyseras. Tilldela lämpliga utbytestider och biokemiskt tillstånd till varje rådatafil som importeras.
      OBS: Data kan importeras och bearbetas i batchar, eller allt på en gång. Om du lägger till data i projektet ångras inte någon analys som tidigare har utförts inom projektet.
  2. När datafilerna har lagts till klickar du på slutför för att påbörja databehandlingen. Efter en kort fördröjning kommer programvaran att fråga om användaren vill spara data innan du fortsätter. Klicka på ja.
    OBS: Den första bearbetningen kan ta upp till flera timmar beroende på hur många prover som analyseras, hur många peptider som finns i den slutliga peptidlistan (steg 4.10), storleken på det kromatografiska fönstret och frekvensen av spektralförvärv.
  3. Om så önskas ändrar du bearbetningsparametrarna på konfigurationsmenyn för att ändra jonsökningsparametrarna. Se till att använda samma jonsökningsparametrar för alla data i ett visst projekt.

7. Analys och visualisering av HDX-data

OBS: När den första bearbetningen av rådata har slutförts (steg 6.2) kommer HDX-bearbetningsprogramvaran att ha lokaliserat peptider från peptidlistan (genererad i steg 4.10) i var och en av de rådatafiler som analyserades. När isotopfördelningen för en peptid i listan finns i en rådatafil representerar HDX-bearbetningsprogramvaran varje isotop med en "pinne" (som i figur 6C−E). De relativa intensiteterna hos pinnarna för en given peptid används sedan för att beräkna deuteriumupptaget i förhållande till referensspektrat. Medan HDX-bearbetningsprogramvaran gör ett beundransvärt jobb med att korrekt tilldela "pinnar" till de flesta peptider, kommer betydande manuell kuration av deuteriumupptagsvärdena fortfarande att krävas.

  1. Analysera värden för peptid deuteriumupptag
    1. Välj den första peptiden i peptidlistan och öppna det staplade spektraldiagramt från menyn Vyer. Rulla upp och ner i det staplade spektradiagramfönstret för att se masspektrat för den valda peptiden som funktion av deuteriumutbytestiden (Figur 7D,E).
    2. Tilldela och ta bort pinnar efter behov med hjälp av musklick för att säkerställa att rätt isotopfördelning har placerats i data och att varje isotoptoppar har tilldelats (tilldelade pinnar visas blått). Genom att klicka på något av spektrat i det staplade spektraldiagramt(bild 7D,E)kan användaren tilldela/ta bort pinnar i det aktiva datavisningsfönstret(bild 7C).
    3. Kontrollera sticktilldelningarna för varje laddningstillstånd genom att växla laddningstillståndet högst upp i det staplade spektraldiagramfönstret.
    4. Upprepa steg 7.1.1−7.1.3 för varje biokemiskt intressetillstånd. Det biokemiska tillståndet kan också släglas högst upp i det staplade spektraldiagramfönstret. För de mest exakta deuteriumupptagsskillnadsmätningarna, se till att pinnar tilldelas för samma uppsättning laddningstillstånd för varje biokemiskt tillstånd.
    5. Upprepa steg 7.1.1−7.1.4 för varje peptid i peptidlistan.
    6. Kontrollera standardavvikelsen för peptid deuteriumupptagsvärden med hjälp av täckningskartan.
      1. Få tillgång till täckningskartan från menyn Vyer, som visar varje peptid i peptidlistan som kartlagts längs aminosyrasekvensen av proteinet av intresse (Figur 8C). Färga peptiderna enligt relativ standardavvikelse (enheter av Da).
      2. Sök visuellt på kartan efter avvikande peptider med hög relativ standardavvikelse. Klicka på avvikande peptider i täckningskartan för att fylla de staplade spektraldiagram(figur 8B)och datavisarfönstret (Figur 8A) med målpeptiden.
      3. Använd den staplade spektralplotten, kontrollera noggrant att alla laddnings tillstånd och alla tidpunkter för avvikande peptiden har lämpligt tilldelade pinnar.
        OBS: Oftast har peptider med stora standardavvikelser (>0,3 Da) isotopiska toppar som inte tilldelades pinnar på lämpligt sätt av programvaran (som anges i figur 8B). Tilldelning av eventuella saknade pinnar gör det i allmänhet möjligt att minska den relativa standardavvikelsen för en peptid till <0,3 Da.
      4. Dölj peptiden från listan om den relativa standardavvikelsen inte kan reduceras till mindre än 0,3 Da.
  2. Exportera HDX-differensdata mellan två biokemiska tillstånd för kartläggning på en strukturell modell av proteinet av intresse.
    1. Visa skillnaden i intresse för täckningskartan. Högerklicka på täckningskartan för att exportera differensdata till en .csv fil. Exportera tillståndsdata (i .csv format) genom att navigera till data | Exportera tillståndsdata i huvudverktygsfältet.
      OBS: Lämplig formatering av differensdata och tillståndsdatafiler finns i stödinformationen.
    2. Importera differensdata, tillståndsdata och pdb-filen för proteinet av intresse till Deuteros28. Välj konfidensintervallet på 99 % , välj aktiverasumma och bearbeta data.
      OBS: MATLAB måste installeras på datorn för att kunna köra Deuteros. Deuteros kommer att använda replikatmätningarna i datauppsättningen för att beräkna standardavvikelsen för upptagsdata för varje peptid. Denna standardavvikelse kommer att användas för att definiera konfidensintervallet för betydande utbyte, som visas på tomterna.
    3. Under PyMOL-alternativ väljer du exportupptag | exportera för att generera ett Pymol-skript för att kartlägga regioner med betydande utbytesskillnad på pdb-strukturen hos proteinet av intresse med PyMOL-programvara.
      OBS: Med hjälp av arbetsflödet som beskrivs i detta protokoll är konfidensintervallet på 99% för signifikant deuteriumupptagsdifferens för en given peptid vid en enda tidpunkt vanligtvis 0,3−0,5 Da. Konfidensintervallet på 99 % för skillnaden som summeras över alla börspunkter är vanligtvis 0,7−1,0 Da.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det är nödvändigt att bedöma kvaliteten på den proteolytiska matsmältningen och reproducerbarheten av arbetsflödet för varje uppsättning provinjektioner. Innan HDX-MS-analyser utfördes är det därför viktigt att fastställa effektiva förutsättningar för proteolys av det protein som är av intresse, för separation av peptider med hjälp av omvänd fas flytande kromatografi och gasfasjonrörlighet och för påvisande av peptider med ms. För detta ändamål bör referensproverna för protein av intresse (som samlats in i avsaknad av deuterium) undersökas först (avsnitt 3). Kromatografiska data i figur 3A−C visar de totala jonkromatogrammen (TIC) för tre referensprover av HalM2 lanthipeptidsyntetas. TIC är den tidsberoende förändringen i summan av alla jonantal vid alla m/z-värden som ingår i masspektrala skanningen. Närmare vyer över TIC mellan 3 och 8 min visas i figur 3D−F. Masspektrat i figur 3G−I representerar en summering av alla masspektra under ett litet tidsintervall (från 5, 0 till 5, 1 min) av varje TIC. Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt följande inslag i figur 3.

För det första representerar den stora toppen nära 9,3 min i slutet av lutningen ofullständigt smälta (och därmed stora och mer hydrofoba) fragment av HalM2 (Figur 3A −C). Matsmältningen skulle kunna effektiviseras genom att HalM2-koncentrationen minskas, men detta kommer att minska peptidsignalens intensitet och signal:brusförhållande. Matsmältningen kan också effektiviseras genom att öka kontakttiden (från 3 min, protokollsteg 3.3.3) med pepsinkolonnen. Ökad kontakttid kommer dock att resultera i mer utbyte av tillbaka. I slutändan måste dessa parametrar balanseras för det protein som är av intresse för att ge önskad sekvenstäckning, signalintensitet och deuteriumretention. För det andra bör formen och intensiteten hos TIC-profilerna vara likartad (som i figur 3D−F). Detta tyder på att proteolytisk matsmältning av HalM2 är reproducerbar och är av liknande effektivitet i alla tre referensproverna. Förväntningen är att en liknande matsmältning av ett deuteriumväxat prov kommer att producera samma uppsättning peptider med liknande retentionstider. För det tredje bör masspektrat under ett givet tidsintervall också vara liknande (figur 3G−I). En snabb visuell jämförelse av det summerade masspektrat över 5,0−5,1 minuters tidsintervall för kromatografisk separation visar att masspektrala signaler i varje prov verkligen är mycket lika, vilket ger förtroende för att liknande peptider finns i varje prov och eluerar vid liknande tidpunkter från C18-kolumnen. En liknande snabb visuell inspektion bör utföras under andra tidsintervall över kromatogrammet.

Efter att visuellt ha verifierat likheten i LC-MS-data i referensproverna används proteomikprogramvara för att söka ms-data efter peptider som härrör från aminosyrasekvensen av proteinet av intresse. Efter att ha definierat proteinsekvensdatabanken (aminosyrasekvensen av proteinet av intresse), bearbetningen och arbetsflödesparametrarna enligt beskrivningen i protokollstegen 4.2−4.4 bearbetas varje enskilt referensprov för att upptäcka septiska peptider som matchar förutsagda peptider som härrör från proteinet av intresse. Ett exempel på proteomikprogramvaran för ett odeklarerat HalM2-referensprov visas i figur 4. Särskild uppmärksamhet bör ägnas följande egenskaper. För det första kommer alla MS-signaler som matchas med en specifik peptid inom proteinet av intresse enligt de värden som definieras i bearbetnings- och arbetsflödesparametrarna att färgas blått i bottenspektrumet. Om ett referensprov "framgångsrikt" bearbetas kommer de flesta signaler att se blå ut (vilket är fallet för uppgifterna i figur 4). Se dessutom till att "OK-filtret" är toggled till den gröna bocken på den övre vänstra panelen. När detta är gjort kommer statistiken i den övre högra panelens övre stapel (markerad i blått i figur 4) endast att återspegla de peptider som ger höga förtroendepoäng. Dessa peptider uppvisar låg ppm massnoggrannhet, flera fragmentjoner och god korrelation mellan fragment och parent jonretentionstider, och anses vara säkra identifieringar. För halM2-referensprovet som visades upptäcktes 1 421 peptider med höga poäng, vilket täcker 99,6% av HalM2-sekvensen. Nära 100% sekvens täckning bör vara uppnåelig för de flesta proteiner med hjälp av nedifrån och upp LC-MS arbetsflöde som beskrivs i protokoll avsnitt 3. Dessutom är ytterligare användbar statistik för varje peptid tabulerad i den övre högra panelen, inklusive massfelet, prekursorretentionstiden, antalet fragment (produktjoner), den fullständiga listan över fragmentjoner efter namn och jonrörlighetens drifttid. Denna information är användbar för tolkningen av resultat, som alltid bör fokuseras på de mest självsäkra identifierade peptiderna.

Den slutliga peptidlistan bör bestämmas genom ytterligare tröskelvärden i HDX-bearbetningsprogramvaran. Efter att ha analyserat referensdata för att generera peptidlistan (protokollavsnitt 4) bör utdata importeras till HDX-bearbetningsprogramvaran för ytterligare tröskel. Utdatafilerna lagras i en katalog enligt definitionen i protokoll steg 4.5 med filtillägget "..._IA_final_peptide.csv". Vid uppladdning av utgången till HDX-bearbetningsprogramvaran kommer den fullständiga listan över peptider att visas i panelen "peptidförhandsvisning" (bild 5), och antalet peptider, sekvenstäckning och redundans kommer att visas i fönstrets nedre högra hörn. Dessa värden ändras i realtid när ytterligare tröskelvärden tillämpas. När du har klickatpå nästa kan tröskelvärden anges i de angivna fälten. De mest kritiska filtren är "filtröskeln" som kräver att alla peptider placeras i vart och ett av de tre referensproverna, "maximalt MH+-fel (ppm)" som ska ställas in på ett värde <10 ppm och "minsta på varandra följande produkter", vilket kräver att peptiden genererar minst två på varandra följande fragmentjoner under MSMS-fasen (dvs. hög kollisionsenergi) i MSE-arbetsflödet (protokollsteg 3.3.7.2).

Den viktigaste tekniska begränsningen av HDX-MS-analysen är det bakre utbytet av deuterium för protium som uppstår så snart deuteriumväxlade prover har släckts (med protierad buffert). Utbytet av tillbaka fortsätter under proteassammanfattningen och LC-MS-delarna av arbetsflödet. Back exchange är oundvikligt, men om pH, temperatur och timing för alla steg efter avsläckning kontrolleras noggrant enligt beskrivningen i protokollet, kan 60%−70% av deuteriumetiketten bibehållas. Av denna anledning är det viktigt att kontrollera under de tidiga stadierna av analysutveckling att de flesta peptiderna behåller deuterium. Detta kan uppnås snabbt genom att jämföra rådata från ett avuterated prov med ett referensprov. Som har gjorts för att säkerställa att referensproverna(figur 3)kan reproduceras jämför du TIC:erna för deuteriumutbytade och outvecklade referensproverna, vilket säkerställer att profilernas former liknar varandra. Summera dessutom masspektrat över samma kromatografiska tidsintervall i båda proverna. De flesta peptiderna i det deuterium utbytta provet bör uppvisa uppenbara förändringar i sina isotopfördelningar mot högre m/z-värden (som i figur 6). Dessa data tyder på att en betydande del av deuterium etiketten upprätthålls under hela syranäckning, pepsin matsmältning och LC-MS data insamling.

När du har kontrollerat att arbetsflödet ger tillräcklig deuteriumretention måste deuteriumupptaget kvantifieras. Således importeras rådata för deuteriumutbytade prover till HDX-bearbetningsprogramvaran. Med hjälp av referensproverna och den slutliga peptidlistan kommer HDX-bearbetningsprogramvaran att hitta peptiderna från peptidlistan i var och en av rådatafilerna och tilldela "pinnar" till var och en av de isotopiska topparna. I de representativa data för HalM2 som visas i figur 7färgas de framgångsrikt tilldelade pinnarna blå i alla spektra. Efter tilldelning av pinnar bestäms centroid m/z-värdet för isotopdistributionen av programvaran och används för att beräkna deuteriumupptaget i förhållande till det outvecklade referensprovet. Deuteriumutbytesvärdet för varje peptid bör kontrolleras manuellt. I figur 7visas den för närvarande utvalda peptiden (HIDKLTVGL, som spänner över HalM2-rester 110−118) på den vänstra panelen i huvuddatavisaren (Figur 7A). De andra panelerna visar HDX-data associerade med denna peptid. Om du klickar på någon peptid i peptidlistan kommer de andra panelerna att fyllas med HDX-data från den peptiden. Figur 7B visar deuteriumupptaget för peptid 110−118. Den här datauppsättningen innehåller fyra utbytespunkter: 0,5, 5, 30 och 240 min (insamlade i tre exemplar). Utbytesdata samlades in för två biokemiska tillstånd: gratis HalM2-enzym (röd) och HalM2-enzymet komplext för AMPPNP och dess substratpeptid HalA2 (blå). Observera den signifikanta skillnaden i deuteriumupptag i peptid 110−118 över hela tidskursen och replikeringsmätningens höga precision (felstaplar visas på tomten i figur 7B). I allmänhet kommer liknande precision i upptagsmätningen att erhållas för de flesta peptider, vilket understryker reproducerbarheten hos arbetsflödet som presenteras i detta protokoll. På ligandbindning (blå kurva i figur 7B)genomgår peptidbindningen mitt i 110−118-regionen HalM2 uppenbarligen ett betydande skydd mot deuteriumutbyte, vilket tyder på att aminosyrorna i regionen 110−118 blir mer stabilt strukturerade på ligandbindning. Efterföljande mutagenes i denna region anges en roll i bindning till föregångaren peptid, HalA220. I figur 7 visas också de staplade spektraldiagrammen för HalM2-tillståndet (figur 7D) och HalM2:AMPPNP:HalA2-staten (Figur 7E). I dessa tomter ökar utbytestiden från botten till toppen. Massökningen av peptid 110−118 vid deuteriumutbyte vid längre tidpunkter framgår av visuell inspektion. Det är också uppenbart att peptid 110−118 upptar mer deuterium i HalM2-tillståndet (Figur 7D) än i fullt liganded tillstånd (Figur 7E). Om det behövs kan användaren manuellt ändra tilldelningen av pinnar i huvuddatavisaren ( figur 7C ) genom att klicka på någon av delpunkterna i figur 7D eller figur 7E. Vid fast tilldelning/otilldelning kommer HDX-bearbetningsprogramvaran att räkna om deuteriumupptagsvärdena och alla tomter uppdateras i realtid. På samma sätt fyller du i datavisaren i panel C för manuell sticktilldelning genom att klicka på enskilda datapunkter i panel B.

Efter att pinnar har tilldelats för varje peptid- och utbytestidpunkt för alla biokemiska tillstånd bör standardavvikelsen för de uppmätta upptagsvärdena kontrolleras. Detta är lättast att utföra med täckningskartan och staplade spektraldiagram(figur 8). I täckningskartan( Figur 8C) väljer du delstat och utbytestid för ränta och väljer sedan standardavvikelse för relativ användning. Peptiderna i täckningskartan kommer att färgas enligt standardavvikelsen i det uppmätta deuteriumupptagsvärdet. På så sätt blir det väldigt enkelt att visuellt identifiera peptider som har isotopstickor feltilldelningar. Om du klickar på avvikande peptid (med hög standardavvikelse) i täckningskartan fylls huvuddatavisaren och det staplade spektradiagramt med HDX-data från avvikande peptid. Sticktilldelningarna för varje tidpunkt och laddningstillstånd kan sedan ändras efter behov för att korrigera det uppmätta upptagsvärdet. Återigen kommer HDX-bearbetningsprogramvaran att uppdatera alla datadisplayer i realtid när sticktilldelningarna ändras.

Efter fullständig kurering av HDX-datauppsättningen måste betydelsen av deuteriumupptagsskillnadsmätningen för varje peptid beaktas före datatolkning. Med hjälp av ett tillvägagångssätt som beskrivs av Engen ochmedarbetare 29har vi uppskattat ett genomsnittligt upptagsvärde på 0,1 ± 0,1 Da för HalM2-proteinet med hjälp av arbetsflödet som beskrivs i ovanstående protokoll20. Det här värdet överensstämmer med de fel som rapporterats av andra för liknande nedifrån och upp, kontinuerliga exchange HDX-arbetsflöden29,30. Nyligen utvecklade Politis och medarbetare Deuteros, ett användbart open source-verktyg (implementerat i MATLAB) för att snabbt fastställa betydande upptagsskillnader i HDX-datauppsättningar28. Representativa indatafiler för Deuteros ("State_Data_for_Deuteros" och "Difference_Data_for_Deuteros") ingår i stödinformationen. Om de exporteras direkt från den HDX-bearbetningsprogram som beskrivs i detta protokoll (Table of Materials), kommer skillnaden och tillståndsdatafilerna att ha lämpligt format för filläsning av Deuteros. Om HDX-data genereras på ett annat LC-MS-system måste datafiler som liknar de som anges i stödinformationen konstrueras manuellt.

Dueteros-arbetsytan visas i figur 9. När data har importerats till Deuteros väljer användaren önskad konfidensgräns (>98% rekommenderas) och klickar på Importera och beräkna. För den förenklade datamappningen väljer du täckning för datatyp och absolut för färgskala. Klicka på rita. För skogsdiagram väljer du binärt filter som datatyp, önskat konfidensfilter och aktiverar summan. Vid klickning av tomtenkommer Deuteros att plotta alla peptider vid varje utbytespunkt som en funktion av deras position i aminosyrasekvensen och deras deuteriumupptagsvärden. Peptider som uppvisar betydande utbyte kommer att färgas antingen röda eller blå, beroende på om peptiden tar upp mer eller mindre deuterium, beroende på skillnaden som beräknas. Det signifikansvärde som rapporteras i varje diagram (från 0,39 till 0,72 Da i de data som anges i figur 9) beräknas utifrån standardavvikelserna för de upptagsskillnader som mäts för varje peptid enligt de replikatmätningar som finns i datauppsättningen. Konfidensintervallen visas som streckade staplar över varje enskild tomt. Om det är aktiverat lägger "Sum" helt enkelt till upptagsskillnaden mätt vid varje tidpunkt för varje peptid. Slutligen, för visualisering av upptagsdata om den tredimensionella strukturen hos proteinet av intresse, välj exportupptag under PyMOL-alternativ och exportera sedan. Deuteros kommer att generera ett PyMOL-skript som kan dras och släppas in i PyMOL-arbetsytan som innehåller den öppna pdb-filen av proteinet av intresse.

HDX-MS-arbetsflödet som presenteras i detta protokoll användes för att karakterisera de biokemiska egenskaperna hos ett enzym (HalM2) som katalyserar en serie post-translationella modifieringar på en genetiskt kodad peptid (HalA2)20. I figur 10visas representativa HDX-MS-resultat för bindning av HalA2-prekursorpeptiden till HalM2:AMP-PNP-komplexet. Panel A visar HalM2-täckningskartan, där färgen anger den relativa upptagsskillnaden mellan det biokemiska tillståndet [HalM2:AMPPNP] och tillståndet [HalM2:AMPPNP:HalA2]. Deuteros användes för att kartlägga dessa upptagsskillnader på en homologimodell av HalM2-enzymet (Figur 10B,C). Peptider som är färgade röda indikerar en minskning av deuteriumupptaget vid HalA2-bindning, vilket tyder på att dessa regioner i HalM2 kan vara direkt involverade i bindning av föregångaren peptid. För att undersöka denna hypotes muterades regionerna I-III och de kinetiska egenskaperna hos variantenzymerna undersöktes. Mutationer i region I och III ledde båda till betydande förändringar i HalA2 peptid bindande affinitet, vilket tyder på att dessa regioner i HalM2 antingen interagerar med peptid substrat direkt, eller är skyldiga att bilda strukturer som möjliggör HalA2 bindande. Däremot hade mutationen i region II ingen effekt på HalA2 bindande affinitet, men denna mutant var nästan saknar katalytisk aktivitet. En förklaring till detta konstaterande är att organisationen av region II som observerats på HalA2-bindning utlöser en konformationsförändring som aktiverar enzymet. Det bör noteras att det före denna studie inte fanns någon information om bindningsläget HalM2-HalA2 eller om de katalytiskt relevanta konformationsändringarna i systemet, främst på grund av att både HalM2:s och HalA2:s stora storlek och flexibla karaktär har förhindrat strukturella studier. Dessa representativa data om HalM2 lanthipeptide synthetase illustrerar således hur HDX-MS kan användas för att snabbt lokalisera funktionellt relevanta regioner av strukturellt dynamiska enzymsystem−även i avsaknad av högupplösta strukturella data.

Figure 1
Bild 1: Ett kontinuerligt utbyte, nedifrån och upp HDX-MS-arbetsflöde. Mer information finns i texten. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: HDX-kursen beror på proteinkonformationsdynamiken(köppen och kstäng) och den pH-beroende frekvensen för kemisk valuta för N-H-bindningarna i proteinstommen för ND-bindningar (kchem). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Representativa LC-MS-uppgifter för referensproverna för tre exemplar av HalM2. Talet i det övre högra hörnet på varje panel representerar det totala jonantalet. Varje rad visar data för ett annat referens exempel. Den förstakolumnen ( A−C) visar de totala jonkromatogrammen (TIC). Den stora toppen på 9,3 min representerar stora, osmälta peptider. Den mellersta kolumnen (D−F) visar en närmare bild av TICs mellan 3 och 8 min. Notera den goda överenskommelsen mellan profilernas former, vilket indikerar en liknande underliggande blandning av peptidsignaler i varje referensprov över hela kromatogrammet. Den tredje kolumnen (G−I) visar masspektra för varje referensprov som genereras genom att summera alla masspektra som registrerats mellan punkt 5.0 och 5.1 min i den kromatografiska körningen. Visuell inspektion av dessa data indikerar att många av samma peptider detekteras i varje prov. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Representativ proteomikprogramvara för ett HalM2-referensprov. Den övre vänstra panelen visar den fullständiga listan över HalM2-härledda septiska peptider som detekterats i MS-data. Observera att "OK-filtret" visar den gröna bocken. Detta filtrerar data enligt förtroendepoängen och tar bort peptididentifieringar med lågt förtroende. Den övre stapeln på den högra panelen (markerad i blått) visar kumulativ statistik för uppsättningen peptider med höga poäng. Den viktigaste statistiken är antalet upptäckta peptider (i detta fall 1 421) och sekvenstäckningen (i detta fall 99,6 %). Ytterligare statistik för varje peptid visas också i den övre högra panelen. Varje kolumn i den här datatabellen kan sorteras. Den nedre panelen visar alla MS-signaler som matchades med en förutspådd HalM2-härledd septisk peptid. Observera att majoriteten av MS-signalerna tilldelades och är färgade blå. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Ytterligare tröskelvärden i HDX-bearbetningsprogramvaran. Proteomics-programvaruutgången för vart och ett av de tre HalM2-referensproverna importeras till HDX-bearbetningsprogramvaran (vänster panel). När du har importerat data utförs ytterligare tröskelvärden (höger panel). Fältet "minsta på varandra följande produkter" avser fragmentjoner som genereras av klyvning av intilliggande peptidbindningar i peptiden. Parametern "minsta MH+-fel" gör det möjligt för användaren att definiera den acceptabla massnoggrannheten, och "filtröskeln" gör det möjligt för användaren att begränsa peptider till endast de peptider som upptäcktes i alla tre referensfilerna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Representativa uppgifter för ett HalM2-referensprov (rött) och ett HalM2-prov inkuberat i D2O-buffert i 5 minuter (grönt). Båda exemplen utsattes för det nedifrån och upp LC-MS-arbetsflöde som beskrivs i protokoll avsnitt 3. Den vänstra kolumnen visar masspektra summerat över tidsfönstret på 6,0−6,1 minuter. De tre högra kolumnerna visar närmare vyer av samma masspektra, där övergången till högre m/z-värden i det avutererade provet (grönt, överst) är uppenbart för de flesta peptidsignalerna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 7
Bild 7: Skärmbild av arbetsytan i HDX-bearbetningsprogrammet. a)Förteckningen över HalM2-härledda peptider som erhållits genom analys av HalM2-referensprover med proteomikprogramvaran (figur 3) och efterföljande tröskelvärden i HDX-bearbetningsprogramvaran (figur 4). Den för närvarande utvalda peptiden (HIDKLTVGL, som spänner över HalM2-rester 110−118) markeras i blått. B)Deuteriumupptagskurvorna (som en funktion av utbytestiden) för de två biokemiska tillstånden av intresse: det fria HalM2-enzymet och HalM2-enzymet som är bundet till AMPPNP och föregångaren lanthipeptid, HalA2. C)Masspektrum av det aktivt utvalda provet (i detta fall ett av de odeuterade HalM2-referensproverna). De blå pinnarna i panel C kan tilldelas/inte tilldelas manuellt efter behov om de inte har tilldelats korrekt av HDX-bearbetningsprogrammet under den första databehandlingen. (D,E) Staplade spektraltomter för HalM2-staten(D)och HalM2:AMPPNP:HalA2-staten (E). Den tidsberoende ökningen av deuteriumupptaget är lätt synlig, liksom upptagsskillnaden mellan de två biokemiska tillstånden. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 8
Figur 8: Minimera standardavvikelsen i uppmätta upptagsvärden. Täckningskartan i HDX-bearbetningsprogramvaran (panel C) ger ett bekvämt sätt att snabbt identifiera peptider med stora standardavvikelser i sina uppmätta deuteriumupptagsvärden. I detta hypotetiska fall är några av isotoptopparna (blå pinnar) för HalM2-härledda peptid som spänner över rester 110−118 otilldelade för 5 minuters utbytestidpunkter (de grå pinnarna i panel B). Detta leder till en stor standardavvikelse i deuteriumupptagsvärdet mätt för 5 minuters utbytestidpunkt. Den stora standardavvikelsen är lätt uppenbar från den blå färgen på peptiden 110−118 i täckningskartan (panel C) och från datapunktsspridningen och den stora felfältet i upptagsdiagrammen (panel A). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 9
Figur 9: Arbetsytan Deuteros. I det här exemplet beräknades upptagsskillnadsvärdena i HDX-bearbetningsprogrammet genom att subtrahera deuteriumupptaget för halm2:AMPPNP:HalA2-tillståndet från halm2:AMPPNP-tillståndet. Målet med jämförelsen var att visualisera hur peptidbindning (HalA2) förändrade den strukturella dynamiken i HalM2:AMPPNP-komplexet. Datauppsättningen innehöll 4 utbytespunkter (0,5, 5, 30 och 240 min). Upptagsskillnaden för varje peptid vid varje börspunkt illustreras i Woods tomter. De färgade peptiderna i Woods-tomterna indikerar peptider som uppvisar en betydande upptagsskillnad, enligt definitionen i standardavvikelsen för de replikatmätningar som finns i datauppsättningen och de användardefinierade konfidensgränser som valts i Deuteros. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 10
Figur 10: HDX-MS-data vägleder funktionell analys av peptidbindning och allosterisk aktivering i lanthipeptidsyntetasen HalM2. Deuteriumupptagsförändringen vid bindning av HalA2-prekursorpeptiden till HalM2 lanthipeptidsyntetas undersöktes. Upptagsskillnaden för varje peptid efter en 5 min utbytesreaktion plottas (A). Denna plot genererades i HDX-bearbetningsprogramvaran. Peptider färgade röda och blå genomgår mindre och mer deuterium upptag, respektive i närvaro av HalA2 peptiden. Dessa HDX "hot spots" är mappade på en HalM2 homologi modell (B, C). Identifieringen av peptider som genomgår betydande utbytesskillnader fastställdes i Deuteros. PyMOL-skriptet som används för att mappa differensvärdena till homologimodellen genererades i Deuteros. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HDX-MS-arbetsflödet som presenteras i detta protokoll ger en anmärkningsvärt robust plattform för kartläggning av rumslig fördelning av strukturellt dynamiska element i proteiner och för att undersöka hur dessa dynamik förändras som svar på stör (ligandbindning, enzym mutagenes, etc.). HDX-MS har flera tydliga fördelar jämfört med andra strukturella biologimetoder som ofta används för att undersöka konformationsdynamik. Framför allt behövs endast små mängder protein. Med hjälp av arbetsflödet som beskrivs häri ger ett 1 ml-prov av 1 μM-protein tillräckligt med material för triplicate HDX-reaktioner som var och en innehåller 5 utbytespunkter. Dessutom finns det praktiskt taget ingen storleksgräns för proteinet av intresse, och proteinkomplex är lika mottagliga för HDX-MS-metoden. Storleksgränsen begränsas endast av i vilken utsträckning de septiska peptiderna kan lösas kromatografiskt och i m/z- och jonrörlighetsdimensionerna. För många proteiner/proteinkomplex kommer HDX-MS således att ge värdefull information om proteinproteininteraktionsgränssnitt, ligandbindningsställen, konformationsdynamik och allosteriska nätverk. Slutligen utförs HDX-reaktionen under milda, nästan inhemska förhållanden utan behov av platsspecifik märkning / teknik av proteinet, vilket bör bidra till att säkerställa att den endogena aktiviteten bevaras. Den huvudsakliga begränsningen av tillvägagångssättet (när det gäller den mekanistiska information som den ger om proteinet av intresse) är att peptidnivån HDX-data är av inneboende låg rumslig upplösning. Data är således tillräckliga för att dra slutsatsen att en förändring i sekundär struktur sker, men de mekanistiska effekterna av den strukturella stören kräver högre upplösning (t.ex. NMR, cryoEM eller röntgenkristall) strukturer, beräkningsstudier och/ eller biokemiska studier för att helt tolka.

För att säkerställa resultatens reproducerbarhet och tillförlitlighet bör flera kritiska aspekter av protokollet hållas i åtanke. För det första är omfattningen av deuteriumutbytet under HDX-reaktionen och omfattningen av ryggutbytet under upp- och analysen starkt beroende av pH, tid och temperatur. Förfarandena för beredning av buffertar, HDX-reaktioner och LC-MS-metoder måste därför vara så systematiska som möjligt för att minimera variationen i dessa fysiska parametrar mellan datamängder. När så är möjligt bör HDX-reaktioner för biokemiska tillstånd som ska jämföras utföras av samma forskare samma dag, och LC-MS-data för dessa prover bör samlas in under på varandra följande dagar med samma sats lösningsmedel. Med tiden kommer effektiviteten i pepsin matsmältningen också att minska, så det är optimalt för prover som kommer att jämföras för att smältas och analyseras inom ett relativt smalt tidsfönster−särskilt om pepsinkolonnen används för att smälta många andra typer av prover. Det är god praxis att regelbundet kontrollera matsmältningseffektiviteten hos pepsinkolonnen med hjälp av ett standardprotein. För att uppnå detta kan ett dedikerat HDX-bearbetningsprogramprojekt inrättas där nysmälta prover kan jämföras med äldre prover för att säkerställa att samma uppsättning målpeptider detekteras med liknande intensiteter.

Medan arbetsflödet som presenteras i detta protokoll bör ge adekvata data för många enzym/ proteinsystem, finns det flera potentiella optimeringspunkter. För det första kan tidsskalan för HDX-reaktionen ändras för att fånga dynamik som är snabbare / långsammare. Framför allt kommer många enzymer att innehålla mycket dynamiska element som blir helt utbytta inom flera sekunder. Om dessa extremt dynamiska element är av intresse, metoder för pre-steady tillstånd, kontinuerlig utbyte HDX-MS har rapporterats i litteraturen31. För det andra kan LC-metodförhållandena lätt ändras för att ändra matsmältningseffektiviteten (som i slutändan bestämmer sekvenstäckningen) och deuteriumretentionen (som i slutändan bestämmer metodens känslighet). Med tanke på varaktigheten och temperaturen i pepsin matsmältningen, långsammare flöde och högre temperatur kommer att gynna mer grundlig matsmältning av proteinet. Proteinkoncentrationen i HDX-analysen kan också ökas om signalintensiteten är för låg eller minskas om pepsin matsmältningen är för ineffektiv. Med tanke på den acetonitrila gradienten som används för att separera de septiska peptiderna på den analytiska C18-kolumnen, kommer en snabbare gradient att bevara deuteriumetiketten, men på bekostnad av den kromatografiska upplösningen av de peptic peptider som finns i den smälta reaktionsblandningen. För mindre proteiner (~200 aminosyror) där färre septiska peptider finns i matsmältningen kan en snabbare LC-gradient vara lättare att implementera. För större proteiner som HalM2 (~ 1 000 aminosyror) behövs en längre gradient för att lösa den ytterligare spektralkomplexitet som genereras av det större antalet peptider i blandningen. I det senare scenariot kan införandet av en separation av gasfasens jonrörlighet bidra till att dramatiskt förbättra analysens toppkapacitet. Införandet av jonrörlighetsseparationen kommer till en kostnad av ett något reducerat signal-till-brusförhållande. Slutligen bör det noteras att medlemsstaternas uppgifter för HDX-proverna inte behöver samlas in i MSE-läge. MSMS-delen av MS E-arbetscykeln (dvs. energisegmentet med hög kollision, steg 3.3.7.2) krävs endast för referensproverna för att definiera peptidlistan (protokollavsnitt 4). Således bör HDX-prover analyseras i MS-endast läge för att öka signal:brusförhållandet.

Om arbetsflödet som beskrivs i detta protokoll fungerar korrekt, bör helt utbyta peptider uppvisa ett relativt deuteriumupptagsvärde på 60%−70%. Om deuteriumupptaget visar sig vara betydligt lägre än detta (för en lösningsmedelsexponerad, oskyddad peptid) är den mest sannolika förklaringen att provets pH-kort förändras under en del av workup/analysen. I det här scenariot bör en mikrotoplektrod användas för att noggrant övervaka pH-korten för HDX-analysen och den släckta reaktionen alikvot. PH för LC-MS-lösningsmedel bör också kontrolleras. För att minimera förekomsten av detta problem rekommenderas starkt att förbereda och lagra koncentrerade lagerlösningar av alla buffertar och reagenser som behövs för analysen (enligt vad som beskrivs i protokollavsnitt 1).

Under de senaste åren har HDX-MS dykt upp som ett kraftfullt analytiskt verktyg för att undersöka proteinstrukturdynamik. Utvecklingen av kommersiellt tillgängliga LC-MS-system utformade och optimerade för HDX-experiment (som det system som används i denna studie och listas i materialen) i kombination med kraftfulla mjukvarupaket, har utvidgat HDX-MS-metoden till många akademiska och industriella laboratorier och har förvandlat vad som en gång var en nischteknik för 15 år sedan till en mer användarvänlig analytisk plattform. Trots begränsningarna i rumslig upplösning ger HDX-MS mycket kvantitativa och reproducerbara mätningar på proteinrörelser och är idealiskt lämpad för att studera konformationsmässigt dynamiska enzymer som är svåra att undersöka med andra metoder. På grund av dessa egenskaper fyller HDX-MS en viktig nisch i strukturbiologin hos oordnade och dynamiska proteinsystem som har relevans inom många grundläggande områden av biologi och medicin. Som sådan förväntas HDX-MS-analyser förbli ett viktigt verktyg i strukturbiologens arsenal under överskådlig framtid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, Canadian Foundation for Innovation och McGill University start-up fonder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) BioBasic NA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) Milipore Sigma UFC501096
acetonitrile Fisher A955-1
AMP-PNP SIGMA A2647-25MG
ATP SIGMA a2383-5G
D2O ALDRICH 435767-100G
formic acid Thermo Fisher 28905
guanidine-HCl VWR 97063-764
HEPES Fisher BP310-1
Magnesium chloride SiGMA-Aldrich 63068-250G
Potassium chloride BioBasic PB0440
potassium phosphate BioBasic PB0445
TCEP Hydrochloride TRC Canada T012500 peptide was synthesized upon request
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
software
Deuteros Andy M C Lau, et al version 1.08
DynamX Waters version 3.0
MassLynx Waters version 4.1
Protein Lynx
Global Server (PLGS)		 Waters version 3.0.3
PyMOL Schrödinger version 2.2.2
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Instrument and equipment
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column Waters 186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column Waters 186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX System Waters
HDX Manager Waters
microtip pH electrode Thermo Fisher 13-620-291
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn Waters 186007233
Waters Synapt G2-Si Waters

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
  2. Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).
  3. Tokuriki, N., Tawfik, D. S. Protein dynamism and evolvability. Science. 324 (5924), 203-207 (2009).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224 (2011).
  6. Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214 (1991).
  7. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Science. 2 (4), 522 (1993).
  8. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  9. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  10. Xiao, K., et al. Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping. Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).
  11. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  12. Masson, G. R., et al. Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments. Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).
  13. Liu, J., et al. An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore. Scientific Reports. 5, 16883 (2015).
  14. Marion, D., et al. Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta. Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).
  15. Balasubramaniam, D., Komives, E. A. Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).
  16. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  17. Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry. Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).
  18. Mitchell, J. L., et al. Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein. Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).
  19. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  20. Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).
  21. Hebling, C. M., et al. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  22. Duc, N. M., et al. Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).
  23. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  24. Reading, E., et al. Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions. Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).
  25. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (81), e50839 (2013).
  26. Lento, C., et al. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464 (2017).
  27. Schowen, K. B., Schowen, R. L. Solvent isotope effects on enzyme systems. Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).
  28. Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry. Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).
  29. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071 (2011).
  30. Burkitt, W., O'Connor, G. Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).
  31. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).

Tags

Biokemi nummer 159 Vätedeuterium utbyter masspektrometri biokemi enzymologi biosyntes naturliga produkter peptider
En plattform för vätedeuteriumutbyte av masspektrometri (HDX-MS) för undersökning av peptidbiosyntetiska enzymer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A… More

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes. J. Vis. Exp. (159), e61053, doi:10.3791/61053 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter