En elektrokæminescensbaseret analyse af MeCP2-proteinvarianter
Summary
Elektrochemiluminescensensimmunoassay (ECLIA) er en ny metode til kvantitativ påvisning af endogene og eksogent anvendte MeCP2-proteinvarianter, som producerer meget kvantitative, præcise og reproducerbare målinger med lav intra- og analysefejl over et bredt arbejdsområde. Her er protokollen for MeCP2-ECLIA i et 96-godt format beskrevet.
Abstract
ECLIA er en alsidig metode, der er i stand til at kvantificere endogene og rekombinant proteinmængder i et 96-brøndformat. For at demonstrere ECLIA effektivitet, denne analyse blev brugt til at analysere iboende niveauer af MeCP2 i mus hjernevæv og optagelse af TAT-MeCP2 i menneskelige dermal fibroblaster. MeCP2-ECLIA producerer meget nøjagtige og reproducerbare målinger med lave intra- og interassayfejl. Sammenfattende udviklede vi en kvantitativ metode til evaluering af MeCP2 proteinvarianter, der kan anvendes i skærme med høj gennemløb.
Introduction
Elektrochemiluminescensimmunassay (ECLIA) er baseret på en proces, der udnytter etiketter designet til at udsende luminescens, når elektrokemisk stimuleret. Det er en bredt anvendelig teknik til kvantitativ påvisning af biologiske analysander i grundindustrien og akademisk forskning, fødevareindustrien samt i klinisk diagnostik1. Almindeligt, en engangs 96-brønd plade med carbon blæk elektroder anvendes. Disse elektroder fungerer som en solid fase bærer for immunassay. Et sekundært antistof er konjugeret til en elektrokælumescerende etiket, og når elektricitet påføres systemet, udløses der en letemission af kemikalieetiketten. En enhed med ultralav støj (CCD) registrerer den lysintensitet, der er direkte proportional med det antigen, der er bundet til opsamlingsantistoffet, hvilket resulterer i kvantificering af den målrettede analysand af prøven2. Sammenlignet med den enzymforbundne immunosorbentassay (ELISA) anses ECLIA for at være fordelagtig, da det giver større følsomhed og reproducerbarhed samt bedre automatisering og konsistens3.
Her analyserede vi methyl-CpG-bindingsprotein 2 (MeCP2) i prøver af human og murine oprindelse samt forskellige varianter af rekombinantproteinet ved hjælp af det nyudviklede ECLIA-system. MecP2 er et X-forbundet nukleinsyrebindende protein, der er kendt for at interagere med methylerede DNA-sekvenser. Dette protein har været involveret i reguleringen af genekspression4,5. Tab-of-funktion mutationer i genet, som koder dette protein er de største syndere forårsager Rett syndrom (RTT), en alvorlig neurodevelopmental lidelse6. En anden MeCP2-relateret lidelse, MECP2 dobbeltarbejde syndrom, fører også til neurologiske symptomer, der kan overlappe med dem af RTT7. Især, kvinder er for det meste påvirket af RTT, mens mænd er for det meste ramt af MECP2 dobbeltarbejde syndrom6,7.
Disse lidelser er forbundet med utilstrækkelige eller overskydende MeCP2 niveauer henholdsvis i centralnervesystemet (CNS). Behandlingsmuligheder for RTT, der indebærer stigende MeCP2-niveauer i CNS, vil derfor skulle undgå de skadelige virkninger, der er forbundet med over mecp27. På grund af dette er en meget følsom og nøjagtig kvantificering af MeCP2-proteinniveauer, som fastsat i ECLIA-systemet, afgørende for fremme af forskning i RTT samt MECP2-duplikering. MECP2 De præcise målinger af endogene og eksogene MeCP2 niveauer fra humane cellelinjer og mus vævsprøver samt en rekombinant protein bestående af menneskelige MeCP2 isoform B (også kendt som isoform e1), og en minimal N-terminal HIV-TAT transduktion domæne (TAT-MeCP2), der har potentiale til at krydse blod-hjerne-barrieren8,,9 præsenteres i dette arbejde.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at måle endogenme MeCP2, rekombinant MeCP2 og TAT-MeCP2 niveauer, en 96-brønd plade ECLIA blev udviklet. Det er blevet påvist, at tab af MeCP2 proteinfunktion fører til RTT syndrom6, for hvilken behandlingen i øjeblikket er begrænset til symptombehandling og fysioterapi. En lovende behandlingsmulighed er den såkaldte proteinsubstitutionsterapi, hvor MeCP2-niveauerne kan titreres op til den nødvendige koncentration12,13,</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er dr. Brigitte Sturm meget taknemmelige for hendes støtte til ECLIA-instrumentet.
Materials
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
- Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
- Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
- Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
- Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
- Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
- Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
- Laccone, F. A. . Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , (2007).
- Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
- Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
- Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
- Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
- Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).
