Method Article

MeCP2 단백질 변이체에 대한 전기 화학 발광 기반 분석

DOI:

10.3791/61054

⸱

May 22nd, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Genetics, Center for Pathobiochemistry and Genetics, Medical University of Vienna (MUV), 2Murdoch Children's Research Institute and Department of Paediatrics, University of Melbourne, Discipline of Child & Adolescent Health, Sydney Medical School, 3Department of Medical Chemistry and Pathobiochemistry, Medical University of Vienna

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전기 화학 발광 면역 분석 (ECLIA)은 내인성 및 외인성 적용 MeCP2 단백질 변이체의 정량적 검출을위한 새로운 접근법으로, 광범위한 작업 범위에 걸쳐 낮은 인트라 및 분석 오류로 높은 정량적, 정확하고 재현 가능한 측정을 생성합니다. 여기서, MeCP2-ECLIA에 대한 프로토콜을 96웰 형식으로 설명한다.

Abstract

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ECLIA는 96 웰 포맷으로 내인성 및 재조합 단백질 양을 정량화할 수 있는 다목적 방법입니다. ECLIA 효율성을 입증하기 위해, 이 분석은 마우스 뇌 조직에서 MeCP2의 본질적인 수준을 분석하고 인간 진피 섬유아세포에서 TAT-MeCP2의 섭취를 분석하는 데 사용되었다. MeCP2-ECLIA는 낮은 분석 및 분석 간 오류로 매우 정확하고 재현 가능한 측정을 생성합니다. 요약하자면, 우리는 고처리량 스크린에서 이용될 수 있는 MeCP2 단백질 변이체의 평가를 위한 정량적인 방법을 개발했습니다.

Introduction

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전기 화학 발광 면역 분석 (ECLIA)는 전기 화학적으로 자극 될 때 발광을 방출하도록 설계된 라벨을 활용하는 프로세스를 기반으로합니다. 그것은 임상 진단 1뿐만 아니라 기초 산업 및 학술 연구, 식품 산업에서 생물학적 분석물의 정량적 검출을 위한 광범위하게 적용 가능한기술이다. 일반적으로 탄소 잉크 전극이 있는 일회용 96웰 플레이트가 사용됩니다. 이들 전극은 면역분석에 대한 고체상 담체로서 작용한다. 이차 항체는 전기 발광 라벨에 공액되고 전기가 시스템에 가해지면 화학 라벨의 발광이 트리거됩니다. 초저잡음 전하 결합 장치(CCD)는 포획 항체에 결합된 항원과 정비례하는 광 강도를 기록하여 샘플2의표적 화된 공액을 정량화합니다. 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)에 비해 ECLIA는 더 높은 감도 및 재현성을 제공하며 더 나은 자동화 및 일관성3을제공함에 있어 유리한 것으로 간주됩니다.

여기서 우리는 새로 개발된 ECLIA 시스템을 사용하여 인간 및 뮤린 기원의 샘플에서 메틸-CpG 결합 단백질 2(MeCP2) 수준뿐만 아니라 재조합 단백질의 상이한 변이체를 분석하였다. MecP2는 메틸화된 DNA 서열과 상호....

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Protocol

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연구 목적을 위한 피부 생검 조달을 위한 승인은 웨스트미드에 있는 아동 병원의 인간 연구 윤리 위원회에서, 오스트레일리아에서 얻었습니다. 동물 실험에 대한 동의는 오스트리아 연방 과학 경제부에서 얻어졌으며, 이는 현지 동물 복지 규정에 따라 수행되었습니다(GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).

참고: ECLIA 시스템의 원리는 그림 1에설명되어 있습니다.

1. 항체 선택

  1. 다양한 MeCP2 항체의 범위에 대한 신호 대 잡음 비를 평가하고 1차 마우스 모노클로날 MeCP2 항체(클론 Mec-168) 및 토끼 폴리클로날 MeCP2 검출 항체(맞춤형)의 조합 내에서 최고의 신호 강도 및 최고 특이성을 식별한다. 이차 항체의 경우, 시스템 특이적항체(물자 표)를사용하며, 이는 또한 실험적으로 검증되었다.
    참고: 표 1은 MeCP2-ECLIA 개발 및 이들의 시험된 희석 범위 동안 검증된 모든 항체에 대한 개요를 제공합니다.

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Results

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ECLIA 시스템의 원리는 그림 1에설명되어 있습니다. 두 개의 MeCP2 변형에 대한 표준 곡선은 그림 2에나와 있습니다. 광범위한 농도(1-1,800 ng/mL)에서 정확한 정량화가 가능했습니다. 도 3에서마우스 뇌 및 HDF에서 유래된 메CP2 수준의 포액을 분석했습니다. 이형에서의 뇌 핵 용해물에서의 MeCP2 발현, 야생형 및 녹아웃 마우스는 도 3A에서비교하였고, 도 3B에서 MeCP2 단백질은 ECLIA를 사용하여 MECP2 결핍 인간 섬유아세포(c.806delG)에서 검출되었다. MECP2 결핍 세포주(c.806delG)에 의한 TAT-MeCP2의 섭취도 시간이 지남에 따라 조사되었다(그림4). 마.......

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Discussion

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내인성 MeCP2, 재조합 MeCP2 및 TAT-MeCP2 수준을 측정하기 위해 96 웰 플레이트 ECLIA가 개발되었습니다. MeCP2 단백질 기능의 손실은 RTT 증후군6으로이어지며, 치료는 현재 증상 관리 및 물리 치료로 제한됩니다. 1개의 유망한 처리 도로는 MeCP2 수준이 그들의 필요로 한 농도까지 적정될 수 있는 소위 단백질 대체 요법입니다12,,13,,14,,15. 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 TAT 융합,단백질의 잠재력은 지난 2년간12,,13,14,,

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

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브리기테 스투름 박사님께 ECLIA 악기를 지원해 주신 것에 대해 매우 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD9779Hypotonic lysis 시약, 추출 버퍼
Bio-Rad 단백질 분석 염료 시약 농축액Bio-Rad Laboratories Inc.500-0006샘플 전처리
검출 AB SULFO-TAG 표지 안티 토끼메조 스케일 진단R32AB-1항체
디스커버리 워크벤치 4.0메조 스케일 디스커버리소프트웨어
DMEM (1X)gibco by Life Technologies41966-029샘플 전처리
Dulbecco' s PBS (sterile)Sigma-AldrichD8537-500ML시료 전처리, 세척 용액, 코팅 용액
EDTASigma-AldrichEDS추출 완충액
소 태아 혈청Sigma-AldrichF9665시료 전처리
글리세롤Sigma-AldrichG2025추출 버퍼
금 판독 버퍼 T (1x) with surfactantMeso Scale 진단R92TGMeCP2, ECLIA 프로토콜
HEPES,Sigma-AldrichH3375Hypotonic lysis 시약, 추출 버퍼
, KIMBLE, Dounce, 조직 분쇄기 세트, Sigma-AldrichD8938시료 전처리
실험실, 셰이커, 흔들림 동작(저속)GFL3014MeCP2, ECLIA 프로토콜
, 염화마그네슘, 육수화물(MgCl*6H20)Sigma-AldrichM2670Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)Abnova CorporationH00004204-P01세포 처리
Microseal B sealBio-Rad Laboratories Inc.플레이트 밀봉
용 MSB1001, 마우스에서 생산, 클론 Mec-168, 정제 된 면역 글로불린Sigma-AldrichM6818-100UL에서 생산; RRID:AB_262075항체, 코팅 용액
MSD 차단제 A메조 스케일 진단R93BA-4차단제
MSD SECTOR 이미저 2400메조 스케일 진단I30AA-0MeCP2 ECLIA 프로토콜
다중 어레이 96웰 플레이트메조 스케일 진단L15XB-3/L11BX-3MeCP2 ECLIA 프로토콜
페니실린-스트렙토마이신gibco by Life Technologies15140122토끼
Eurogentec S.A.에서 생산되는 시료 전처리 Polyclonal Anti-MeCP2맞춤형 항체
염화칼륨 (KCl)Merck KGaA1049361000Hypotonic lysis 시약
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)Sigma-AldrichSAB1404063; RRID:AB_10737296항체
1차 AB 마우스, anti-MeCP2 (4B6)Sigma-AldrichWH0004204M1; RRID:AB_1842411항체
기본 AB 마우스, anti-MeCP2 (Mec-168)Sigma-AldrichM6818; RRID:AB_262075항체
기본 AB 마우스, anti-MeCP2 (Men-8)Sigma-AldrichM7443; RRID:AB_477235항체
일차 AB 토끼, 항-MeCP2 (D4F3)세포 신호 기술3456S; RRID:AB_2143849항체
프로테아제 억제제 칵테일 (100X)Sigma-Aldrich8340Hypotonic lysis 시약, 추출 버퍼
2차 AB, 토끼, anti-MeCP2Eurogentec S.A.맞춤형항체
2차 AB, 토끼, anti-MeCP2Merck07-013항체
염화나트륨(NaCl)Sigma-AldrichS3014추출 버퍼
SULFO-TAG 라벨링된 안티 토끼 항체(염소)Meso Scale DiagnosticsW0015528S항체
TAT-MeCP2 융합 단백질사내 생산세포 치료
25200-056세포 처리Trypsin EDTA 0.25%(1X)gibco
: , , , , , , Life Technologies 트윈 20 Sigma-Aldrich P9416 세척 용액의

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
  2. Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electr....

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