En elektrochemiluminescensbasert analyse for MeCP2 proteinvarianter
Summary
Elektrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) er en ny tilnærming for kvantitativ påvisning av endogene og eksogene brukte MeCP2 proteinvarianter, som produserer svært kvantitative, nøyaktige og reproduserbare målinger med lav intra- og inter-analyse feil over et bredt arbeidsområde. Her er protokollen for MeCP2-ECLIA i et 96-brønnformat beskrevet.
Abstract
ECLIA er en allsidig metode som er i stand til å kvantifisere endogene og rekombinant proteinmengder i et 96-brønnformat. For å demonstrere ECLIA effektivitet, denne analysen ble brukt til å analysere iboende nivåer av MeCP2 i mus hjernevev og opptaket av TAT-MeCP2 i menneskelige dermal fibroblaster. MeCP2-ECLIA produserer svært nøyaktige og reproduserbare målinger med lav intra- og interanalysefeil. Oppsummert utviklet vi en kvantitativ metode for evaluering av MeCP2 proteinvarianter som kan brukes i skjermer med høy gjennomstrømning.
Introduction
Elektrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) er basert på en prosess som benytter etiketter designet for å avgi luminescens når elektrokjemisk stimulert. Det er en bredt anvendelig teknikk for kvantitativ påvisning av biologiske analytter i grunnleggende industri og akademisk forskning, næringsmiddelindustrien samt i klinisk diagnostikk1. Vanligvis brukes en engangs 96-brønnplate med karbonblekkelektroder. Disse elektrodene fungerer som en solid fase bærer for immunoassay. Et sekundært antistoff er konjugert til en elektrochemiluminescerende etikett, og når elektrisitet påføres systemet, utløses lettutslipp av den kjemiske etiketten. En ultra-lav støy lade-koblet enhet (CCD) registrerer lysintensiteten som er direkte proporsjonal med antigenet bundet til fangstantistoffet som resulterer i kvantifisering av den målrettede aalyten til prøven2. Sammenlignet med enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA), anses ECLIA å være fordelaktig, da det gir høyere følsomhet og reproduserbarhet samt bedre automatisering og konsistens3.
Her analyserte vi metyl-CpG bindingprotein 2 (MeCP2) nivåer i prøver av menneskelig og murine opprinnelse samt ulike varianter av rekombinant protein ved hjelp av det nyutviklede ECLIA-systemet. MecP2 er et X-koblet nukleinsyrebindende protein som er kjent for å samhandle med metylerte DNA-sekvenser. Dette proteinet har vært innblandet i reguleringen av genuttrykk4,5. Tap av funksjon mutasjoner i genet som koder dette proteinet er de viktigste skyldige forårsaker Rett syndrom (RTT), en alvorlig neurodevelopmental lidelse6. En annen MeCP2-relatert lidelse, MECP2 dupliseringssyndrom, fører også til nevrologiske symptomer som kan overlappe med rtt7. Spesielt er kvinner for det meste påvirket av RTT mens menn er for det meste plaget av MECP2 dupliseringsyndrom6,7.
Disse lidelsene er forbundet med henholdsvis utilstrekkelige eller overskytende MeCP2-nivåer i sentralnervesystemet (CNS). Behandlingsalternativer for RTT som involverer økende MeCP2-nivåer i CNS må derfor unngå de skadelige effektene forbundet med overskudd av MeCP27. På grunn av dette faktum er en svært følsom og nøyaktig kvantifisering av MeCP2 proteinnivåer, som gitt av ECLIA-systemet, avgjørende for utviklingen av RTT samt MECP2 dupliseringsyndromforskning. De nøyaktige målingene av endogene og eksogene MeCP2-nivåer fra humancellelinjer og musevevsprøver samt et rekombinant protein bestående av humanmeCP2 isoform B (også kjent som isoform e1), og et minimalt N-terminal HIV-TAT transduksjonsdomene (TAT-MeCP2) som har potensial til å krysse blod-hjerne-barriere8,,9 er presentert i dette arbeidet.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å måle endogene MeCP2- og TAT-MeCP2-nivåer ble det utviklet en 96-brønnplate ECLIA. Det har vist seg at tap av MeCP2 proteinfunksjon fører til RTT syndrom6, for hvilken behandling er for tiden begrenset til symptombehandling og fysioterapi. En lovende behandlingsvei er den såkalte proteinerstatningsterapien, hvor MeCP2-nivåer kan titreres opp til deres nødvendige konsentrasjon12,,13,14,</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er veldig takknemlige til Dr. Brigitte Sturm for hennes støtte til ECLIA-instrumentet.
Materials
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
- Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
- Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
- Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
- Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
- Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
- Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
- Laccone, F. A. . Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , (2007).
- Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
- Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
- Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
- Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
- Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).
