MeCP2 Protein Varyantları için Elektrokemilüminesans Bazlı Bir Test
Summary
Elektrokemilüminesans immünoassay (ECLIA), geniş bir çalışma aralığında düşük intra ve inter-assay hatası ile yüksek nicel, doğru ve tekrarlanabilir ölçümler üreten endojen ve eksojen olarak uygulanan MeCP2 protein varyantlarının kantitatif tespiti için yeni bir yaklaşımdır. Burada, 96-iyi formatta MeCP2-ECLIA için protokol açıklanmıştır.
Abstract
ECLIA, endojen ve rekombinant protein miktarlarını 96-iyi formatta ölçebilen çok yönlü bir yöntemdir. ECLIA verimliliğini göstermek için bu analiz, fare beyin dokusundaki MeCP2’nin içsel düzeylerini ve insan dermal fibroblastlarında TAT-MeCP2 alımını analiz etmek için kullanılmıştır. MeCP2-ECLIA, düşük intra ve inter-assay hatası ile son derece doğru ve tekrarlanabilir ölçümler üretir. Özetle, yüksek iş itme ekranlarında kullanılabilen MeCP2 protein varyantlarının değerlendirilmesi için nicel bir yöntem geliştirdik.
Introduction
Elektrokemilüminesans immünoassay (ECLIA), elektrokimyasal olarak uyarıldığında lüminesans yayan etiketleri kullanan bir işleme dayanmaktadır. Bu temel sanayi ve akademik araştırma, gıda endüstrisi nin yanı sıra klinik tanı1biyolojik analitlerin kantitatif tespiti için geniş bir uygulama tekniğidir. Genellikle karbon mürekkep elektrotlu tek kullanımlık 96 kuyuluk bir plaka kullanılır. Bu elektrotlar immünoassay için katı faz taşıyıcı olarak hareket. İkincil bir antikor elektromilüminesans etikete konjuge edilir ve sisteme elektrik uygulandığında kimyasal etiketin ışık salınımı tetiklenir. Ultra düşük gürültü şarj lı bir cihaz (CCD) ışık yoğunluğunu kaydeder ve bu durum, yakalama antikoruna bağlı antijenle doğru orantılıdır ve bu da numunenin hedeflenen analitinin sayısallaştırılmasıile sonuçlanır2. Enzime bağlı immünosorbent çıktısı (ELISA) ile karşılaştırıldığında, ECLIA daha yüksek duyarlılık ve tekrarlanabilirlik yanı sıra daha iyi otomasyon vetutarlılık3 sunduğu için avantajlı olarak kabul edilir.
Burada insan ve mürin kökenli örneklerde metil-CpG bağlayıcı protein 2 (MeCP2) düzeyleri nin yanı sıra yeni geliştirilen ECLIA sistemini kullanarak rekombinant proteinin farklı varyantlarını analiz ettik. MecP2, metillenmiş DNA dizileri ile etkileşime girdiği bilinen X’e bağlı bir nükleik asit bağlayıcı proteindir. Bu protein gen ekspresyonunun düzenlenmesinde yer almıştır4,5. Bu proteini kodlayan gendeki fonksiyon kaybı mutasyonları, ciddi bir nörogelişimsel bozukluk olan Rett sendromuna (RTT) neden olan başlıca suçlulardır6. Başka bir MeCP2 ile ilgili bozukluk, MECP2 çoğaltma sendromu, aynı zamanda RTT ile örtüşebilir nörolojik belirtilere yol açar7. Özellikle, erkekler çoğunlukla MECP2 çoğaltma sendromu6,,7etkilenir ken özellikle, kadınlar çoğunlukla RTT etkilenir.
Bu bozukluklar merkezi sinir sisteminde (CNS) sırasıyla yetersiz veya fazla MeCP2 düzeyleri ile ilişkilidir. Bu nedenle, CNS artan MeCP2 düzeylerini içeren RTT için tedavi seçenekleri MeCP27aşırı ile ilişkili zararlı etkileri önlemek gerekir. Bu nedenle, ECLIA sistemi tarafından sağlanan MeCP2 protein düzeylerinin son derece hassas ve doğru bir niceliği, RTT’nin ilerlemesi ve MECP2 tekrar sendromu araştırması için çok önemlidir. İnsan hücre hatları ve fare doku örneklerinden endojen ve eksojen MeCP2 düzeylerinin kesin ölçümleri ve insan MeCP2 izoform B ‘den (izoform e1 olarak da bilinir) oluşan rekombinant protein ve kan-beyin bariyerini aşma potansiyeline sahip minimal N-terminal HIV-TAT transdüksiyon etki alanı (TAT-MeCP2) bu çalışmada8,sunulmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endojen MeCP2, rekombinant MeCP2 ve TAT-MeCP2 düzeylerini ölçmek için 96 kuyulu bir eclia plaka geliştirilmiştir. Bu MeCP2 protein fonksiyonukaybı RTT sendromu yol açtığı gösterilmiştir6, hangi tedavi şu anda semptom yönetimi ve fizik tedavi ile sınırlıdır. Bir umut verici tedavi cadde sözde protein replasman tedavisi, MeCP2 düzeyleri kendi ihtiyaç duydukları konsantrasyon12kadar titrated olabilir12 ,13,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Eclia aletine verdiği destekten dolayı Dr. Brigitte Sturm’a çok müteşekkiriz.
Materials
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
- Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
- Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
- Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
- Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
- Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
- Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
- Laccone, F. A. . Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , (2007).
- Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
- Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
- Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
- Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
- Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).
