Denna järn redox speciation metod är baserad på kapillärelektrofores-induktivt kopplade plasma masspektrometri med provstapling kombinerat med kort analys i en körning. Metoden analyserar och ger snabbt låga kvantifieringsgränser för järn redox arter över ett varierat spektrum av vävnader och biofluidprover.
Dyshomeosasis av järn metabolism redovisas i den patofysiologiska ramen för ett flertal sjukdomar, inklusive cancer och flera neurodegenerativa tillstånd. Överdriven järn resulterar i fri redox-aktiv Fe(II) och kan orsaka förödande effekter inom cellen som oxidativ stress (OS) och död genom lipid peroxidation kallas ferroptos (FPT). Därför är kvantitativa mätningar av järn (Fe(II)) och järnjärn (Ferc(III)) snarare än total Fe-bestämning nyckeln för närmare insikt i dessa skadliga processer. Eftersom Fe(II)/(III) bestämningar kan hämmas av snabba redox-state-skift och låga koncentrationer i relevanta prover, som ryggmärgsvätskan (CSF), bör metoder finnas tillgängliga som analyserar snabbt och ger låga kvantifieringsgränser (LOQ). Kapillärelektrofores (CE) erbjuder fördelen av snabb Fe(II)/Fe(III) separation och fungerar utan en stationär fas, vilket skulle kunna störa redoxbalansen eller orsaka analyt fastnar. CE kombinerat med induktivt kopplade plasma masspektrometri (ICP-MS) som en detektor erbjuder ytterligare förbättring av detektionskänslighet och selektivitet. Den presenterade metoden använder 20 mM HCl som bakgrundselektrolyt och en spänning på +25 kV. Toppformer och koncentrationsdetekteringsgränser förbättras genom konduktivitet-pH-stapling. För reduktion på 56[ArO]+,opererades ICP-MS i läget dynamic reaction cell (DRC) med NH3 som reaktionsgas. Metoden uppnår en gräns för detektion (LOD) på 3 μg/L. På grund av stapling var högre injektionsvolymer möjliga utan att hämma separationen men förbättra LOD. Kalibreringar relaterade till topparea var linjära upp till 150 μg/L. Mätprecisionen var 2,2% (Fe(III)) till 3,5% (Fe(II)). Migration tid precision var <3% för båda arterna, bestäms i 1:2 utspädda lysater av mänskliga neuroblastom (SH-SY5Y) celler. Återhämtningsexperiment med standardtillsats visade på noggrannhet på 97% Fe(III) och 105 % Fe(II). I verkliga bio-prover som CSF, migrationstiden kan variera beroende på varierande ledningsförmåga (dvs salthalt). Således bekräftas toppidentifiering genom standardtillsats.
Idag är det tydligast att järnmedierad oxidativ stress (OS) spelar en avgörande roll i flera störningar specifikt i neurodegenerativa hjärnsjukdomar, som Alzheimers och Parkinsons sjukdom samt i cancer1,2,3,4. OS är nära besläktad med tillståndet och balansen i redox-paret Fe(II)/Fe(III). Medan Fe(III) är redox-inaktiv, Fe(II) potent genererar reaktiva syrearter (ROS) genom att katalysera H2O2 sönderdelning följt av hydroxylradikala produktion och membranlipidperoxidation5,6. På molekylär nivå, Fe(II)-genererade ROS och peroxiderade fosfolipider är en stark attack mot integriteten hos proteiner, lipider och DNA7,8. Sådan skadlig cellulär dysfunktion visades att framkalla mitokondriell dysfunktion med minskad ATP-innehåll9 och kan även utlösa en programmerad nekrotisk celldöd, känd som ferroptos (FPT)10,11. Därför kvantitativa Fe(II)/(III) redox speciation är av eminent betydelse i ett brett spektrum av redox-relaterade störningar.
Kemisk speciation är ett väletablerat verktyg för studier av spårämnen biologisk roll och metabolism i allmänhet7,8 samt vid neurodegenerativa tillstånd12,13,14,15,16,17. Metoder för Fe-redox speciation finns i litteraturen är vanligtvis baserade på flytande kromatografi (LC) separation. En del av litteraturen använder induktivt kopplade plasma masspektrometri (ICP-MS) som ett element selektiv detektor. Men i rutin LC arbete, behövdes överdriven utrensning gånger mellan körningar. Ännu mer problematiska, batch-till-batch-variation av LC-kolumner tvingade re-optimering av elution villkor efter varje kolumn förändring. Dessa problem hämmar hög genomströmning. Ytterligare tid krävs för att få acceptabel tillförlitlighet och grundligt utvärdera metoden igen.
För att kringgå dessa nackdelar presenteras här en metod för Fe(II)/Fe(III) redoxspeciering baserad på kapillärelektrofores induktivt kopplade plasma masspektrometri (CE-ICP-MS). CE erbjuder olika fördelar jämfört med LC18. Kapillärer har ingen stationär fas och därmed beror (nästan) inte på satsidentitet. När de åldras eller blockeras, ersätts de snabbt, visar vanligtvis oförändrad prestanda. Utrensnings- och rengöringsstegen mellan proverna är effektiva och korta, och analystiden per prov är också kort.
Den presenterade metoden är tillförlitlig med goda siffror av meriter. Som ett proof-of-princip, är metoden tillämpas på mänskliga dopaminerga neuroblastom (SH-SY5Y) cell lysate, ett prov typ viktigt i neurodegeneration samt cancerforskning19.
Eftersom järn spelar en framträdande roll i OS progression, därmed underlätta mitokondriell dysfunktion eller FTP, en mångsidig CE-ICP-MS baserad kvantitativ metod för samtidig Fe(II)/Fe(III) speciation presenteras i denna artikel och dess tillämpning är exemplariskt visat i cell lysates. Metoden som kort analystid och siffrorna för meriter (LOQ, precision, återhämtning) är lämpliga för prover som är relevanta för järn redox speciation specifikt i neurodegenerativa och cancerforskning. Jämfört med tidigare metoder baserade på LC är denna CE-baserade metod praktiskt taget oberoende av kolumnbates och tidigare observerade reproducerbarhetsproblem efter LC-kolumnbyte. Kapillärpreparering före varje körning är <4 minuter och analystid per prov med måttlig salthalt upp till 3 min. Bortsett från molekylladdning och storlek beror migrationstiden i CZE på konduktivitet vid provpluggen, vilket orsakar variation i migrationstid eller skiftningar när proverna själva påverkar konduktiviteten avsevärt. Sådana förändringar i migrationstiden är välkända i kapillärelektrofores. Detta är en CZE-immanent problem, känd frånlitteraturen 21,22. Standarder och SH-SY5Y cell lysates hade måttlig och homogen ledningsförmåga. Följaktligen visade migrationstider endast små förändringar med god precision. För prover med hög ledningsförmåga kan dock förlängda migrationstider observeras upp till 5 min. Därför rekommenderas standardtillbeslag för klar artidentifiering.
En kritisk fråga i järn redox-artbildning är artstabilitet (dvs. upprätthållande av Fe(II)/(III) jämvikt) underprovberedning 8,13. Olämpliga pH- eller kelatkemikalier samt olämpliga lagringsförhållanden som syre (luft) som kommer i kontakt med prov eller ett avbrott i djupfryst lagring kan lätt ändra Fe(II)/(III)balansen. Därför valdes för beredning av SH-SY5Y cell lysates, en lys buffert utan några kelaterande kemikalier, fysiologiska pH, men inert gas överlagring under provberedning, i prov behållare och omedelbar djup frysning tillämpades för dessa prover.
I litteraturen kan man hitta semi-kvantitativa tillvägagångssätt för att övervaka Fe(II). För förbättrad förståelse av järn roll i oxidativ stress, flera forskargrupper utvecklat Fe(II)-specifika sonder att semi-kvantitativt övervaka och visualisera avvikande höjd av järn järn in vitro. Men viktigt att notera, sådana sonder inte anser Fe(III) och inte kvantifiera utan rapportera bara “mer” eller “mindre” Fe(II)). Hittills har endast ett fåtal biomarkörer finns tillgängliga för att bestämma OS och FPT, som beror på bristen på tillförlitliga metoder för att samtidigt kvantifiera Fe(II)/Fe(III) redox art23,24. Med detta i åtanke, den presenterade metoden – underlätta snabb kvantifiering av båda, Fe(III) och Fe(II) i en körning – kan bli ett lovande verktyg för att fördjupa insikten i järn-beroende molekylära processer.
The authors have nothing to disclose.
VV stöddes av det intramurala forskningsanslaget (Forschungsförderung) vid University Medical Center Göttingen och Else Kröner forskningsprogram av Else Kröner-Fresenius-Stiftung.
CE capillary | CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany | 105180-25 | |
CE system | PrinCe technolgies | 0005.263 | model PrinCe 760 |
Conical Superclear Tubes 15 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777704 | |
Conical Superclear Tubes 50 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777694 | |
FeCl2 * 4H2O | Merck | 103861 | |
FeCl3 | Merck | 803945 | |
Fluidflex Silikon HG-Schlauch | ProLiquid | 4001106HG | |
Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm | Chromatographie Service GmbH | 105180-25 | |
hydrochloric acid, 1 M | Merck | 1101652500 | corrosive |
ICP-MS | Perkin Elmer | N814003 | |
Luer, 3-way female | BioRad | 7318229 | |
Luer, cone male | neoLab Migge | 2-1895 | |
Luer, male | neoLab Migge | 2-1880 | |
Peakfit peak evaluation software | Systat | PeakFit 4.12 | |
Pt-wire | Carl Roth | 0737.1 | |
PVC tube | ProLiquid | 6000002 | |
RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
Tetramethylammoniumhydroxide, 25 % | Merck | 814748 | corrosive |
TYGON-tube R-3607 | ProLiquid | 3700203A |