En modifierad tvånjure en klippmusmodell av reninreglering vid njurartärstenos

Summary

En modifierad 2 njure 1 clip (2K1C) Goldblatt musmodell utvecklades med hjälp av polyuretanslangar för att initiera njurartärstenos, vilket inducerar en ökning av reninuttryck och njurskada. Här beskriver vi en detaljerad procedur för att förbereda och placera manschetten på njurartären för att generera en reproducerbar och konsekvent 2K1C-musmodell.

Abstract

Njurartärstenos är ett vanligt tillstånd hos patienter med kranskärlssjukdom eller perifer kärlsjukdom där renin angiotensin aldosteronsystemet (RAAS) är överaktiverat. I detta sammanhang finns det en förträngning av njurartärerna som stimulerar en ökning av uttrycket och frisättningen av renin, det hastighetsbegränsande proteaset i RAAS. Den resulterande ökningen av reninuttryck är en känd drivkraft för renovaskulär hypertoni, ofta förknippad med njurskada och organskador. Således finns det ett stort intresse för att utveckla nya behandlingar för detta tillstånd. Den molekylära och cellulära mekanismen för reninkontroll vid njurartärstenos är inte helt förstådd och motiverar ytterligare undersökning. För att inducera njurartärstenos hos möss utvecklades en modifierad 2 njure 1 klipp (2K1C) Goldblatt-musmodell. Den högra njuren stenoserades hos vilda möss och skenopererade möss användes som kontroll. Efter njurartärstenos bestämde vi reninuttryck och njurskada. Njurar skördades och färska kortiker användes för att bestämma protein- och mRNA-uttryck av renin. Denna djurmodell är reproducerbar och kan användas för att studera patofysiologiska svar, molekylära och cellulära vägar som är involverade i renovaskulär hypertoni och njurskada.

Introduction

Njurartärstenos (RAStenosis) är ett svårlöst problem som drabbar cirka 6% av personer över 65 år och hos upp till 40% av personer med kranskärlssjukdom^eller perifer kärlsjukdom ^1,2. Nuvarande behandlingar för sjukdomen är begränsade; Därför finns det ett kritiskt behov av att utveckla nya terapier för att behandla renovaskulär hypertoni eller resistent hypertoni inducerad av RAStenosis. Renin angiotensin aldosteron system (RAAS) är den viktigaste vägen som är involverad i patogenesen av RAStenosis inducerad hypertoni eller renovaskulär hypertoni ^3,4. Kända terapier riktade mot RAAS, såsom ACE-hämmare eller angiotensinreceptorblockerare, lindrar högt blodtryck, men behöver noggrant undersökas för njursvikt och hyperkalemi ^5,6,7. Renin katalyserar det hastighetsbegränsande steget i RAAS; det omvandlar angiotensinogen till angiotensin I. Vid ateroskleros orsakar plackbildning förträngning av njurartären som driver reninsekretion, vilket resulterar i renovaskulär hypertoni och njurskada⁸. Ett antal studier har rapporterat ökade nivåer av oxidativ stress under renovaskulär hypertoni hos människor, vilket bekräftades med de två njure ett klipp (2K1C) mössmodellen samt andra hypertensiva djurmodeller 2,9,10,11,12,13,14,15,16 . Den molekylära mekanismen för reninuttryckskontroll under RAStenosinducerad renovaskulär hypertoni är inte väl förstådd och motiverar ytterligare undersökning.

Experimentella djurmodeller som på ett tillförlitligt och reproducerbart sätt rekapitulerar RAStenos är viktiga för att belysa de cellulära och molekylära mekanismerna för reninuttryckskontroll för utveckling av nya terapier. 2K1C-musmodellen är en väletablerad experimentell modell för att studera patogenesen av renovaskulär hypertoni^17,18,19,20. Denna modell genereras av förträngning av njurartären med hjälp av ett klipp 17,20,21, vilket ger njurartärocklusion som resulterar i en ökning av reninuttryck och hypertoni^17,19,20,21. Det finns dock inga tekniska rapporter tillgängliga, som beskriver en steg för steg-procedur för att generera njurartärstenos i djurmodeller.

Konventionella U-formade silverklämmor, polyuretanrör och andra klämmor har använts för att begränsa njurartären för att inducera njurartärstenos. Vissa studier har visat att klippets design och material är avgörande för att få tillförlitliga och reproducerbara data med 2K1C-djurmodellen. Enligt Lorenz et al., användningen av konventionella U-designade silverklipp inducerar en låg framgångsgrad för högt blodtryck (40-60%)²¹. På grund av klämdesignen pressas njurartären i sidled, vilket utlöser några förträngningar och större sannolikhet att lossna från njurartären. Silverformbarhet och duktilitet kan tillåta förändringar i klämbredder; Därför orsakar olika högt blodtrycksnivåer bland möss. Silverdioxider på klämman kan orsaka perivaskulär inflammation, intimal proliferation och vävnadsgranulering, vilket förändrar njurartärdiametern²². På grund av variationen i nivåerna av högt blodtryck som erhållits med det konventionella U-designsilverklämman har Warner et al. och Lorenz et al. framgångsrikt använt en rundare polyuretanslang för att initiera njurartärstenos hos möss, vilket genererar en mer tillförlitlig och konsekvent induktion av de två njurarna ett klipp djurmodell^20,21.

I denna rapport beskriver vi ett kirurgiskt protokoll för att generera experimentell RAStenos hos möss, med hjälp av polyuretanslangen för att begränsa njurartären. Manschetten med rund design av polyuretan är ett mer reproducerbart, pålitligt och billigt klipp för att generera stenos i musen. Målet med denna experimentella modell är att studera och definiera den molekylära och cellulära mekanismen för reninuttryckskontroll under njurartärstenos. Vi bekräftade framgången för RAStenosis mössmodell genom att mäta reninuttryck och njurskademarkör neutrofil gelatinasassocierad lipocalin (N-GAL).

Protocol

Möss inhystes och vårdades vid Vanderbilt University Medical Center (VUMC) Division of Animal Care enligt riktlinjerna från National Institutes of Health (NIH) och Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, US Department of Health and Human Services. Alla djurförsök godkändes av VUMC Institutional Animal Care and Use Committee innan försöken påbörjades. 1. Beredning och dissektion av djur Slå på värmedynans groning och vattenpump ca 30 min innan operationen påbö…

Representative Results

Njurartärförträngning ökar reninuttrycket i den stenoserade njuren medan den undertrycker uttrycket i den kontralaterala njuren. De två njurarna ett klipp (2K1C) eller Goldblatt modell av stenos inducerar ökat reninuttryck och njurskada. Detta är erkänt som den bästa representativa modellen för ensidig njurartärstenos hos människor. Uttryck av renin och prorenin (föregångare till renin) mättes med hjälp av immunoblotting. Data visar att renin- och proreninuttrycket ökade i de…

Discussion

Njurartärstenos är en viktig orsak till sekundär eller resistent hypertoni och njurskada ^1,29. Goldblatt-modellen med två njurar (2K1C) har använts för att studera RAStenos-inducerad renovaskulär hypertoni 1,17,18,19. Ett antal tidigare studier med olika djurmodeller har visat att stenos i njurartären är en stark stimulator fö…

Materials

Diet Gel	Clear H2O	Diet-Gel 76A	Surgery recovery diet
EMC Heated Hard pad	Hallowell	000A2788B	Heating pads were used to keep mice warm
Ethilon Nylon Suture	Ethicon	662G	4-0 (1.5 metric), This suture was used to close the peritoneum, and skin
Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2815 G	8-0 (0.4 metric), This suture was used to close cuff to tie and constrict the artery
Germinator 500	Braintree Scientific Inc.	GER 5287	Sterilize surgical tools between surgeries
Ketoprofen	Zoetis	Ketofen	Painkiller
Polyurethane	Braintree Scientific Inc.	MRE-025	This tube was used to initiate stenosis
Povidone-iodine antiseptic swabsticks	Medline	MDS093901	It was applied after hair removal and surgery on the skin
Reflex 7 Clip Applier	Roboz Surgical Instrument Co	204-1000	This clip applier was used to apply clip in case one or more sutures went off
Sterile towel drapes	Dynarex	4410	It was used as a bedsheet for mice during surgery
Triple antibiotic ointment	Medi-First	22312
Water pump	Stryker	T/pump Professionals	Used to warm and circulate water in the heating hard pad to keep mice warm during and post-surgery