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환경과학

MicroARN À base de virus de la pomme de terre X Silençage (VbMS) dans la pomme de terre.

Published: May 11, 2020
doi:
10.3791/61067
, ,
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas,Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology,Texas A&M University

Summary

Nous présentons un protocole détaillé pour le système de silençage microARN (VbMS) à base du virus X de la pomme de terre (PVX) pour caractériser fonctionnellement les microARN endogènes (miARN) dans la pomme de terre. Les molécules d’imitation cible (TM) de miARN d’intérêt sont intégrées dans le vecteur PVX et exprimées transitoirement dans la pomme de terre pour faire taire la famille de miARN ou miARN cible.

Abstract

Le silençage des microARN à base de virus (VbMS) est un outil rapide et efficace pour la caractérisation fonctionnelle des microARN (miARN) dans les plantes. Le système VbMS a été développé et appliqué pour diverses espèces végétales, notamment Nicotiana benthamiana, la tomate, l’Arabidopsis, le coton et les plantes monocotylédones telles que le blé et le maïs. Ici, nous décrivons un protocole détaillé utilisant des vecteurs VbMS basés sur PVX pour faire taire les miARN endogènes dans la pomme de terre. Pour éliminer l’expression d’un miARN spécifique, des molécules d’imitation cible (TM) de miARN d’intérêt sont conçues, intégrées dans des vecteurs de virus végétaux et exprimées dans la pomme de terre par infiltration d’Agrobacterium pour se lier directement au miARN endogène d’intérêt et bloquer sa fonction.

Introduction

Les microARN végétaux (miARN) sont caractérisés comme des ARN régulateurs codés nucléairement de 20 à 24 nucléotidiques1 et jouent un rôle fondamental dans presque tous les aspects des processus biologiques des plantes, y compris la croissance et le développement2,3, la photosynthèse et le métabolisme4,5,6,7, la synthèse et la signalisation hormonales8,9, les réponses biotiques et abiotiques10, 11,12,13, et la régulation des nutriments et de l’énergie14,15. Les rôles régulateurs des miARN végétaux sont bien programmés et remplis généralement aux niveaux post-transcriptionnels en clivant ou en réprimant par translation les ARNm cibles.

D’énormes progrès ont été réalisés en ce qui concerne l’identification, le profilage transcriptionnel et la prédiction des miARN dans la pomme de terre16,17,18,19,20,21. Cependant, la caractérisation fonctionnelle des miARN dans les plantes, y compris la pomme de terre, a pris du retard par rapport à d’autres organismes en raison du manque d’approches génétiques efficaces et à haut débit. Il est difficile d’effectuer une analyse fonctionnelle des miARN individuels par analyse standard de perte de fonction, car la plupart des miARN appartiennent à des familles présentant une redondance génétique considérable22. De plus, un seul miARN peut contrôler plusieurs gènes cibles23 et plusieurs miARN différents peuvent moduler la même voie moléculaire de manière collaborative24,25. Ces propriétés rendent difficile la caractérisation de la fonction d’un miARN spécifique ou d’une famille de miARN.

Une grande partie de l’analyse fonctionnelle des miARN s’est fortement appuyée sur des approches de gain de fonction qui ont des limites évidentes. La méthode des miARN artificiels (amiRNA) exploite les transcriptions primaires endogènes (pri-miARN) pour produire des miARN à un niveau élevé, conduisant à l’inhibition de l’expression du gène cible26,27,28,29. Cependant, le marquage d’activation et la surexpression de miARN à l’aide d’un puissant promoteur constitutif de 35S conduisent souvent à une expression accrue de miARN qui ne sont pas représentatifs des conditions in vivo et peuvent donc ne pas refléter la fonction endogène des miARN30. Une autre approche a été développée impliquant l’expression de formes résistantes aux miARN de gènes cibles contenant des mutations indésirables dans les sites de liaison et/ou de clivage31,32,33. Mais cette approche peut également potentiellement entraîner une mauvaise interprétation du phénotype dérivé du transgène cible résistant aux miARN en raison d’artefacts transgéniques. Par conséquent, les conclusions de ces études sur le gain de fonction doivent être tirées avec prudence34. Une autre limitation majeure des approches décrites ci-dessus est qu’elles nécessitent une transformation, ce qui nécessite beaucoup de travail et de temps. De plus, les approches dépendantes du transgène ne sont guère applicables aux espèces végétales transformatrices-récalcitrantes. Par conséquent, il est essentiel de développer une approche rapide et efficace de perte de fonction pour démêler la fonction des miARN.

Pour contourner la condition préalable de la procédure de transformation, le silençage des microARN à base de virus (VbMS) a été établi en combinant les stratégies d’imitation de cible (TM) avec des vecteurs dérivés du virus. Dans le système VbMS, les molécules de MT conçues artificiellement sont exprimées transitoirement à partir d’une colonne vertébrale virale, offrant un outil puissant, à haut débit et permettant de gagner du temps pour disséquer la fonction des miARN endogènes végétaux35,36. VbMS a été initialement développé chez N. benthamiana et la tomate avec le virus du hochet du tabac (TRV)35,36,37 et a été étendu à Arabidopsis, coton, blé et maïs en utilisant divers autres systèmes d’expression du virus, y compris le virus de la pomme de terre X (PVX)38, le virus de la déformation des feuilles de coton (ClCrV)39, le virus de la mosaïque du concombre (CMV)40,41,42, le virus de la mosaïque du blé chinois (CWMV)43 et le virus de la mosaïque des bandes d’orge (BSMV)44,45.

La pomme de terre (Solanum tuberosum) est la quatrième culture vivrière la plus importante et la culture non céréale la plus cultivée au monde, principalement en raison de sa valeur nutritionnelle élevée, de sa production d’énergie élevée et de ses besoins en intrants relativement faibles46. Plusieurs caractéristiques de la pomme de terre en font une plante modèle dicotylédone attrayante. Il s’agit d’une culture polyploïde à multiplication végétative avec un taux de croisement élevé, une hétérozygotie et une diversité génétique élevée. Cependant, à ce jour, il n’existe aucun rapport caractérisant la fonction des miARN dans la pomme de terre utilisant VbMS. Nous présentons ici une approche VbMS de pomme de terre basée sur le PVX de pomme de terre adaptée au clonage indépendant de la ligature (LIC) pour évaluer la fonction des miARN dans les plants de pommes de terre38. Nous avons choisi la famille miR165/166 pour illustrer le test VbMS parce que la famille miR165/166 et leurs ARNm cibles et les facteurs de transcription homéodomaine/fermeture à glissière Leu de classe III (HD-ZIP III) ont été largement caractérisés22,47,48. Les gènes HD-ZIP III sont des régulateurs clés du développement du méristème et de la polarité des organes, et la suppression de la fonction miR165/166 conduit à une expression accrue des gènes HD-ZIP III, entraînant des défauts de développement pléotropes tels qu’une dominance apicale réduite et des modèles aberrants de polarité des feuilles22,35,38,41 . Les phénotypes de développement facilement enregistrables corrélés avec le silence des miRNA165/166 permettent une évaluation précise de l’efficacité du test VbMS à base de PVX.

Dans cette étude, nous démontrons que le système VbMS basé sur PVX peut bloquer efficacement la fonction des miARN dans la pomme de terre. Étant donné que le système de silençage génique induit par le virus (VIGS) à base de PVX a été établi dans un certain nombre de variétés de pommes de terre49,50,51,52, cette approche VbMS basée sur PVX peut probablement être appliquée à un large éventail d’espèces de pommes de terre diploïdes et tétraploïdes.

Protocol

1. Cultivez des plants de pommes de terre. Propager des plants de pommes de terre in vitro dans des tubes de culture (25 x 150 mm) avec des milieux Murashige et Skoog (MS) plus la vitamine de Gamborg (mélange de sel basal MS, vitamine gamborg, 30 g/L de saccharose, 3,5 g/L de gélose, pH = 5,7). Placez les tubes dans la salle de croissance sous 20–22 °C, 16 h de photopériode claire/8 h sombre et intensité lumineuse 120 μmol/m2∙s1.REMARQUE: De nouvelles pousses et racines se d?…

Representative Results

La figure 2 montre les plants de pommes de terre PVX-STTM165/166 (Katahdin) avec une croissance ectopique des tissus foliaires du côté abaxial de la lame des feuilles le long des veines. Des phénotypes plus sévères tels que la formation de feuilles en forme de trompette ont également été observés. En revanche, aucune anomalie phénotypique n’a été observée dans les usines témoins pvx. Ces résultats montrent que le système VbMS était efficace pour supprimer la fonction endog…

Discussion

Nous présentons un système de silencieux miARN à base de PVX pour caractériser la fonction des miARN endogènes dans la pomme de terre en intégrant la conception STTM dans le vecteur PVX. Le système VbMS s’est avéré efficace pour faire taire les miARN165/166 dans la pomme de terre, une famille de miARN hautement conservée parmi les espèces végétales.

L’approche DE MT a été développée pour interférer avec l’expression des miARN sur la base d’une imitation artificielle d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Yule Liu de l’Université Tsinghua d’avoir fourni le vecteur PVX-LIC. Ce travail a été soutenu par un fonds de démarrage du Texas A & M AgriLife Research et le projet Hatch TEX0-1-9675 de l’USDA National Institute of Food and Agriculture à JS.

Materials

100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter – 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S
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Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).
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