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환경과학

Virus della patata Silenziamento del microRNA basato sull'X (VbMS) nella patata.

Published: May 11, 2020
doi:
10.3791/61067
, ,
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas,Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology,Texas A&M University

Summary

Presentiamo un protocollo dettagliato per il sistema di silenziamento dei microRNA (VbMS) basato sul virus della patata X (PVX) per caratterizzare funzionalmente i microRNA endogeni (miRNA) nella patata. Le molecole mimiche bersaglio (TM) di miRNA di interesse sono integrate nel vettore PVX ed espresse transitoriamente in patata per silenziare il miRNA bersaglio o la famiglia di miRNA.

Abstract

Il silenziamento di microRNA basato su virus (VbMS) è uno strumento rapido ed efficiente per la caratterizzazione funzionale dei microRNA (miRNA) nelle piante. Il sistema VbMS è stato sviluppato e applicato per varie specie vegetali tra cui Nicotiana benthamiana, pomodoro, Arabidopsis, cotone e piante monocotiledoni come grano e mais. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che utilizza vettori VbMS basati su PVX per silenziare i miRNA endogeni nella patata. Per abbattere l’espressione di uno specifico miRNA, vengono progettate molecole bersaglio mimico (TM) di miRNA di interesse, integrate in vettori di virus vegetali ed espresse in patate dall’infiltrazione di Agrobacterium per legarsi direttamente al miRNA endogeno di interesse e bloccarne la funzione.

Introduction

I microRNA vegetali (miRNA) sono caratterizzati da 20-24 RNA regolatori a base di nucleotidi, codificati nucleari1 e svolgono un ruolo fondamentale in quasi tutti gli aspetti dei processi biologici delle piante, tra cui crescita e sviluppo2,3, fotosintesi e metabolismo4,5,6,7, sintesi e segnalazione ormonale8,9, risposte biotiche e abiotiche10, 11,12,13 e regolazione dei nutrienti e dell’energia14,15. I ruoli regolatori dei miRNA vegetali sono ben programmati e soddisfatti tipicamente a livelli post-trascrizionali mediante scissione o repressione traslazionale degli mRNA bersaglio.

Sono stati compiuti enormi progressi verso l’identificazione, la profilazione trascrizionale e la previsione target dei miRNA nella patata16,17,18,19,20,21. Tuttavia, la caratterizzazione funzionale dei miRNA nelle piante, compresa la patata, è rimasta indietro rispetto ad altri organismi a causa della mancanza di approcci genetici efficienti e ad alto rendimento. È difficile eseguire l’analisi funzionale dei singoli miRNA mediante l’analisi standard della perdita di funzione, perché la maggior parte dei miRNA appartiene a famiglie con notevole ridondanza genetica22. Inoltre, un singolo miRNA può controllare più geni bersaglio23 e diversi miRNA possono modulare lo stesso percorso molecolare in modo collaborativo24,25. Queste proprietà rendono difficile caratterizzare la funzione di uno specifico miRNA o di una famiglia di miRNA.

Gran parte dell’analisi funzionale dei miRNA si è basata fortemente su approcci di guadagno di funzione che hanno evidenti limitazioni. Il metodo dei miRNA artificiali (amiRNA) sfrutta i trascritti primari endogeni (pri-miRNA) per produrre miRNA ad alto livello, portando all’inibizione dell’espressione genica bersaglio26,27,28,29. Tuttavia, il tagging di attivazione e la sovraespressione di miRNA utilizzando un forte promotore costitutivo 35S spesso portano ad una maggiore espressione di miRNA che non sono rappresentativi delle condizioni in vivo e quindi potrebbero non riflettere la funzione endogena dei miRNA30. È stato sviluppato un approccio alternativo che coinvolge l’espressione di forme di geni bersaglio resistenti ai miRNA che contengono mutazioni uncleavable nei siti di legame e/o scissione31,32,33. Ma questo approccio può anche potenzialmente causare un’interpretazione errata del fenotipo derivato dal transgene bersaglio resistente ai miRNA a causa di artefatti transgenici. Pertanto, le conclusioni di questi studi sul guadagno di funzione devono essere tratte con cautela34. Un altro importante limite degli approcci sopra descritti è che richiedono una trasformazione, che richiede molta manodopera e tempo. Inoltre, gli approcci transgenici-dipendenti sono difficilmente applicabili per le specie vegetali trasformatrici-recalcitranti. Pertanto, è essenziale sviluppare un approccio rapido ed efficiente alla perdita di funzione per svelare la funzione dei miRNA.

Per aggirare il prerequisito della procedura di trasformazione, è stato stabilito il silenziamento di microRNA basato su virus (VbMS) combinando le strategie mimiche target (TM) con vettori derivati da virus. Nel sistema VbMS, le molecole tm progettate artificialmente sono espresse transitoriamente da una spina dorsale del virus, offrendo uno strumento potente, ad alto rendimento e risparmio di tempo per sezionare la funzione dei miRNA endogeni delle piante35,36. VbMS è stato inizialmente sviluppato in N. benthamiana e pomodoro con il virus del sonaglio del tabacco (TRV)35,36,37 ed è stato esteso a Arabidopsis, cotone, grano e mais utilizzando vari altri sistemi di espressione del virus, tra cui il virus della patata X (PVX)38, il virus dell’accartocciamento delle foglie di cotone (ClCrV)39, il virus del mosaico del cetriolo (CMV)40,41,42, il virus cinese del mosaico del grano (CWMV)43 , e il virus del mosaico a strisce d’orzo (BSMV)44,45.

La patata (Solanum tuberosum) è la quarta coltura alimentare più importante e la coltura non cereale più coltivata al mondo principalmente a causa del suo elevato valore nutrizionale, dell’elevata produzione di energia e del fabbisogno di input relativamente basso46. Diverse caratteristiche della patata ne fanno un’attraente pianta modello dicotiledone. È una coltura poliploide propagata vegetativamente con alto tasso di outcrossing, eterozigosi e diversità genetica. Tuttavia, ad oggi, non esiste alcun rapporto che caratterizzi la funzione dei miRNA nella patata utilizzando VbMS. Qui presentiamo un approccio VbMS basato su PVX di patate adattato alla clonazione indipendente dalla legatura (LIC) per valutare la funzione dei miRNA nelle piante di patate38. Abbiamo selezionato la famiglia miR165/166 per illustrare il test VbMS perché la famiglia miR165/166 e i loro mRNA target e i fattori di trascrizione hd-ZIP III (omeodomain/Leu zipper) di Classe III sono stati ampiamente caratterizzati22,47,48. I geni HD-ZIP III sono regolatori chiave dello sviluppo del meristema e della polarità degli organi, e la soppressione della funzione miR165/166 porta ad una maggiore espressione dei geni HD-ZIP III, con conseguenti difetti dello sviluppo pleotropico come la ridotta dominanza apicale e modelli aberranti di polarità fogliare22,35,38,41 . I fenotipi dello sviluppo facilmente ottenibili correlati con il silenziamento di miRNA165/166 consentono una valutazione accurata dell’efficacia del test VbMS basato su PVX.

In questo studio, dimostriamo che il sistema VbMS basato su PVX può bloccare efficacemente la funzione dei miRNA nella patata. Poiché il sistema di silenziamento genico indotto da virus basato su PVX (VIGS) è stato stabilito in un certo numero di varietà di patate49,50,51,52, questo approccio VbMS basato su PVX può essere probabilmente applicato a una vasta gamma di specie di patate diploidi e tetraploidi.

Protocol

1. Coltiva piante di patate. Propagare in vitro le piante di patate in tubi di coltura (25 x 150 mm) con mezzi Murashige e Skoog (MS) più la vitamina di Gamborg (miscela di sale basale MS, vitamina di Gamborg, 30 g/L di saccarosio, 3,5 g/L di agar, pH = 5,7). Posizionare i tubi nella stanza di crescita a meno di 20-22 °C, 16 ore di luce/8 ore di fotoperiodo scuro e intensità luminosa 120 μmol/m2∙s1.NOTA: Nuovi germogli e radici normalmente si sviluppano in 1-2 settimane dalle pia…

Representative Results

La Figura 2 mostra le piante di patata PVX-STTM165/166 (Katahdin) con crescita ectopica dei tessuti fogliari dal lato abassiale della lamina fogliare lungo le vene. Sono stati osservati anche fenotipi più gravi come la formazione di foglie a forma di tromba. Al contrario, non è stata osservata alcuna anomalia fenotipica negli impianti di controllo PVX. Questi risultati mostrano che il sistema VbMS era efficace nel sopprimere la funzione endogena dei miRNA nelle piante di patate tetraploidi…

Discussion

Presentiamo un sistema silenziatore di miRNA basato su PVX per caratterizzare la funzione dei miRNA endogeni nella patata integrando il design STTM nel vettore PVX. Il sistema VbMS si è dimostrato efficace nel silenziare il miRNA165/166 nella patata, una famiglia di miRNA altamente conservata in tutte le specie vegetali.

L’approccio TM è stato sviluppato per interferire con l’espressione dei miRNA basati su un miRNA artificiale bersaglio mimico che è progettato per creare un ciclo di mismat…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dr. Yule Liu della Tsinghua University per aver fornito il vettore PVX-LIC. Questo lavoro è stato supportato da un fondo di start-up del Texas A & M AgriLife Research e dal progetto Hatch TEX0-1-9675 dall’USDA National Institute of Food and Agriculture a JS.

Materials

100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter – 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S
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Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).
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