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환경과학

감자에서 감자 바이러스 X 기반 마이크로RNA 침묵 (VbMS)

Published: May 11, 2020
doi:
10.3791/61067
, ,
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas,Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology,Texas A&M University

Summary

감자에서 내인성 마이크로RNA(miRNA)를 기능적으로 특성화하기 위해 감자 바이러스 X(PVX)기반 의 미생물RNA 침묵(VbMS) 시스템에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 미RNA의 표적 모방(TM) 분자는 PVX 벡터에 통합되고 표적 miRNA 또는 miRNA 제품군을 침묵시키기 위해 감자에서 일시적으로 발현된다.

Abstract

바이러스 기반 마이크로RNA 침묵(VbMS)은 식물에서 microRNAs(miRNAs)의 기능적 특성화를 위한 신속하고 효율적인 도구입니다. VbMS 시스템은 니코티아나 벤타미안, 토마토, 아라비도시스, 면, 밀과 옥수수 와 같은 모노코트 식물 등 다양한 식물종에 개발 및 적용되었습니다. 여기에서는 PVX 기반 VbMS 벡터를 사용하여 감자내생 내성 miRNAs를 침묵시키기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 특정 miRNA의 발현을 무너뜨리기 위해, 관심 있는 miRNA의 표적 모방(TM) 분자는 설계되고, 식물 바이러스 벡터에 통합되고, Agrobacterium 침투에 의해 감자에 발현되어 내인성 miRNA에 직접 결합하고 그 기능을 차단한다.

Introduction

식물 microRNAs (miRNAs)는 20-24 뉴클레오티드 길이의 핵 으로 인코딩 된 규제 RNAs1로 특징 지어지며 성장 및 개발, 광합성 및 신진 대사4,5,6,7, 호르몬 합성 및 신호 8,9, 생물학적 반응 10, 생물학적 및 생물학적 반응을 포함하여 식물 생물학적 과정의 거의 모든 측면에서 근본적인 역할을합니다. 11,12,13, 영양 및 에너지 조절14,15. 식물 miRNA의 규제 역할은 잘 프로그래밍되고 대상 mRNA를 분개하거나 번역하여 전사 후 수준에서 일반적으로 충족됩니다.

감자 16,17,18,19,20,21에서 miRNAs의 식별, 전사 프로파일링 및 표적 예측을 향한 엄청난 진전이 이루어졌습니다. 그러나 감자를 포함한 식물에서 miRNAs의 기능적 특성화는 효율적이고 높은 처리량 유전 적 접근법의 부족으로 인해 다른 유기체보다 뒤쳐졌습니다. 대부분의 miRNAs는 상당한 유전 중복을 가진 가족에 속하기 때문에, 기능 분석의 표준 손실에 의해 개별 miRNA의 기능 분석을 수행하는 것은 도전적입니다222. 또한, 단일 miRNA는 다중 표적 유전자23 및 여러 상이한 miRNA를 제어할 수 있어 동일한 분자 경로를 공동으로 조절할 수 있다24,25. 이러한 특성은 특정 miRNA 또는 miRNA 제품군의 기능을 특성화하기 어렵게 만듭니다.

miRNAs의 기능 적 분석의 대부분은 명백한 한계가있는 기능의 이득 접근 방식에 크게 의존했습니다. 상기 인공 miRNA(amiRNA) 방법은 내인성 1차 성적증명서(pri-miRNAs)를 높은 수준에서 생성하여 표적 유전자 발현의 억제로 이어집니다26,27,28,29. 그러나, 강력한 구성 35S 프로모터를 이용한 활성화 태깅 및 miRNA 과발현은 종종 생체 내 조건을 대표하지 않는 miRNAs의 고조된 발현으로 이어지므로 miRNAs30의 내인성 기능을 반영하지 않을 수 있다. 결합 및/또는 분열 부위에 항만 돌연변이를 포함하는 미RNA 내성 형태의 표적 유전자의 발현을 포함하는 대안적인 접근법이 개발되었다31,32,33. 그러나 이 접근법은 또한 잠재적으로 형질화 성 유물로 인해 miRNA 내성 표적 트랜스진에서 파생된 표현형의 오해를 일으킬 수 있다. 따라서 이러한 기능 의 이득 연구에서 결론주의34 그려야 한다. 위에서 설명한 접근 방식의 또 다른 주요 제한사항은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되는 변환이 필요하다는 것입니다. 또한, 트랜스진 의존성 접근법은 변성 식물 종에 거의 적용되지 않습니다. 따라서 miRNAs의 기능을 해명하기 위해 빠르고 효율적인 기능 상실 접근 법을 개발하는 것이 필수적입니다.

변환 절차의 전제 조건인 바이러스 기반 마이크로RNA 침묵(VbMS)은 표적 모방(TM) 전략을 바이러스 유래 벡터와 결합하여 확립되었다. VbMS 시스템에서 인공 적으로 설계된 TM 분자는 바이러스 백본에서 일시적으로 발현되어 강력한 고처리량 및 시간 절약 도구를 제공하여 식물 내인성 miRNAs35,36의 기능을 해부합니다. VbMS는 처음에 N에서 개발되었습니다. 담배 딸랑이 바이러스(TRV)35,36,37 을 사용한 벤타미안과 토마토는 감자 X(PVX)38, 면잎 구겨진 바이러스(ClCrV)39, 오이 모자이크 바이러스(CMV)40,412,CWM바이러스(CMV)를 포함한 다양한 바이러스 발현 시스템을 사용하여 아라비도시스, 면, 밀 및 옥수수로 확장되었습니다. , 보리 스트라이프 모자이크 바이러스 (BSMV)44,45.

감자(Solanum tuberosum)는 영양가가 높고 에너지 생산량이 높고 입력 요건이 상대적으로 낮기 때문에 주로 세계에서 가장 중요한 식품 작물이자 가장 널리 재배된 비시리얼 작물입니다. 감자의 몇 가지 특징은 매력적인 이질 모델 식물을 만든다. 그것은 높은 횡단 속도 식물성 전파 폴리 플로이드 작물, 이종성, 유전 적 다양성. 그러나 현재까지 VbMS를 사용하여 감자에서 miRNAs의 기능을 특성화하는 보고서는 없습니다. 여기서는 감자 식물38에서 miRNAs의 기능을 평가하기 위해 리그션 독립적 복제(LIC) 조정 된 감자 PVX 기반 VbMS 접근 방식을 제시합니다. miR165/166 제품군과 대상 mRNA 및 클래스 III 동종 도메인/Leu zipper(HD-ZIP III) 전사 요인이 광범위하게 특징지어졌기 때문에 VbMS 분석방법을 설명하기 위해 miR165/166 제품군을 선택했습니다222,47,48. HD-ZIP III 유전자는 메리스템 발달 및 장기 극성의 주요 조절제이며, miR165/166 기능의 억제는 HD-ZIP III 유전자의 발현이 증가하여 잎 극성의 감소된 어포형 지배력 및 비정상적인 패턴과 같은 흉부 발달 결함의 결과로 22,35,411 . miRNA165/166의 침묵과 상관관계가 있는 쉽게 접할 수 있는 발달 표현형은 PVX 기반 VbMS 분석의 효과를 정확하게 평가할 수 있게 해주다.

이 연구에서는 PVX 기반 VbMS 시스템이 감자에서 miRNAs의 기능을 효과적으로 차단할 수 있음을 보여줍니다. PVX 기반 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS) 시스템은 다수의 감자 품종에 설치되어 있기 때문에49,50,51,52, 이 PVX 기반 VbMS 접근법은 광범위한 디플로이드 및 테트라피드 감자 종에 적용될 가능성이 있다.

Protocol

1. 감자 식물을 성장. 무라시게와 스쿠그(MS) 미디어와 감보르그 비타민(MS 기저염 혼합물, 감보리의 비타민, 30g/L 수당, 3.5g/L agar, pH = 5.7)을 함유한 배양 튜브(25 x 150mm)에 체외 감자 식물을 전파합니다. 20-22°C, 16h 라이트/8h 다크 포토기간, 빛 강도 120 μmol/m2∙s1 아래 성장실에 튜브를 놓습니다.참고 : 새로운 싹과 뿌리는 일반적으로 식물에서 1-2 주에 개발됩니다. 매달 신선?…

Representative Results

도 2 는 정맥을 따라 잎 라미나의 축축측에서 잎 조직의 자궁 내성장을 가진 PVX-STTM165/166 감자 식물(Katahdin)을 나타낸다. 나팔 모양의 잎 형성과 같은 더 심각한 표현형도 관찰되었다. 대조적으로, PVX 대조공장에서는 현상이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 VbMS 시스템이 테트라클로드 감자 식물에서 내인성 miRNA 기능을 억제하는 데 효과적이었으며 PVX-VbMS 시스템은 특정 miRNA ?…

Discussion

STTM 설계를 PVX 벡터에 통합하여 감자내성 miRNAs의 기능을 특성화하기 위해 PVX 기반 miRNA 침묵 시스템을 제시합니다. VbMS 시스템은 식물 종에 걸쳐 매우 보존 된 miRNA 가족인 감자에서 miRNA165/166을 침묵시키는 데 효과적이라는 것이 입증되었습니다.

TM 접근법은 표적 miRNA의 격리 및 그 활동의 체포를 초래하는 miRNA 보충 서열 내의 예상 분열 부위에서 불일치 루프를 생성하도록 설?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 PVX-LIC 벡터를 제공한 칭화 대학의 율류 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 텍사스 A&M 농업 연구및 미국 농무부(USDA) 국립 식품 농업 연구소에서 JS에 이르기까지 해치 프로젝트 TEX0-1-9675의 스타트업 펀드에 의해 지원되었습니다.

Materials

100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter – 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S
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Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).
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