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환경과학

Silenciador de microRNA baseado em vírus de batata (VbMS) na batata.

Published: May 11, 2020
doi:
10.3791/61067
, ,
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas,Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology,Texas A&M University

Summary

Apresentamos um protocolo detalhado para o sistema de silenciamento de microRNA baseado em vírus de batata X (PVX) para caracterizar funcionalmente microRNAs endógenas (miRNAs) na batata. As moléculas de mímica alvo (TM) de miRNA de interesse são integradas ao vetor PVX e transitavelmente expressas na batata para silenciar a família miRNA ou miRNA alvo.

Abstract

O silenciamento de microRNA baseado em vírus (VbMS) é uma ferramenta rápida e eficiente para caracterização funcional de microRNAs (miRNAs) em plantas. O sistema VbMS foi desenvolvido e aplicado para várias espécies vegetais, incluindo Nicotiana benthamiana, tomate, Arabidopsis, algodão e plantas monocotas, como trigo e milho. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado usando vetores VbMS baseados em PVX para silenciar miRNAs endógenas na batata. Para derrubar a expressão de um miRNA específico, moléculas de mímica-alvo (TM) de miRNA de interesse são projetadas, integradas em vetores de vírus vegetais, e expressas em batata pela infiltração de Agrobacterium para se ligar diretamente ao miRNA endógeno de interesse e bloquear sua função.

Introduction

As microRNAs (miRNAs) são caracterizadas como RNAs1 regulatórias codificadas por 20 a 24 anos, codificadas por armas nucleares e desempenham papéis fundamentais em quase todos os aspectos dos processos biológicos das plantas, incluindo crescimento e desenvolvimento2,3, fotossíntese e metabolismo4,5,6,7, síntese hormonal e sinalização 8,9, respostas biográficas e abióticas10, 11,12,13, e regulação de nutrientes e energia14,15. Os papéis regulatórios das miRNAs vegetais são bem programados e cumpridos tipicamente em níveis pós-transcrição, apertando ou reprimindo translacionadamente os mRNAs alvo.

Foram feitos enormes progressos na identificação, perfil transcricional e previsão de metas de miRNAs em batata16,17,18,19,20,21. No entanto, a caracterização funcional de miRNAs em plantas, incluindo batata, tem ficado para trás de outros organismos devido à falta de abordagens genéticas eficientes e de alto rendimento. É desafiador realizar a análise funcional do miRNA individual por análise padrão de perda de função, pois a maioria dos miRNAs pertencem a famílias com considerável redundância genética22. Além disso, um único miRNA pode controlar múltiplos genes-alvo23 e vários miRNAs diferentes podem modular a mesma via molecular de forma colaborativa24,25. Essas propriedades dificultam a caracterização da função de um miRNA específico ou de uma família miRNA.

Grande parte da análise funcional das miRNAs tem se apoiado fortemente em abordagens de ganho de função que têm limitações óbvias. O método artificial miRNA (amiRNA) explora as transcrições primárias endógenas (pri-miRNAs) para produzir miRNAs em alto nível, levando à inibição da expressão genética alvo26,27,28,29. No entanto, a marcação de ativação e a superexpressão do miRNA usando um forte promotor 35S constitutivo muitas vezes levam a uma expressão aumentada de miRNAs que não são representativas de condições in vivo e, portanto, podem não refletir a função endógena do miRNAs30. Uma abordagem alternativa foi desenvolvida envolvendo a expressão de formas resistentes ao miRNA de genes-alvo que contêm mutações impuros nos locais de ligação e/ou decote31,32,33. Mas essa abordagem também pode potencialmente causar má interpretação do fenótipo derivado do transgene alvo resistente ao miRNA devido a artefatos transgênicos. Portanto, as conclusões desses estudos de ganho de função devem ser tomadas com cautela34. Outra grande limitação das abordagens acima descritas é que elas requerem transformação, que é intensiva em mão-de-obra e demorada. Além disso, as abordagens dependentes de transgene dificilmente são aplicáveis para espécies de plantas recalcitrantes de transformação. Portanto, é essencial desenvolver uma abordagem rápida e eficiente de perda de função para desvendar a função dos miRNAs.

Para contornar o pré-requisito do procedimento de transformação, o silenciamento microRNA baseado em vírus (VbMS) foi estabelecido combinando as estratégias de imitação de alvo (TM) com vetores derivados do vírus. No sistema VbMS, moléculas de TM projetadas artificialmente são expressas transitoriamente a partir de uma espinha dorsal do vírus, oferecendo uma poderosa ferramenta de alta produtividade e economia de tempo para dissecar a função de miRNAs 35,36 endógenos vegetais. O VbMS foi inicialmente desenvolvido em N. benthamiana e tomate com o vírus do chocalho de tabaco (TRV)35,36,37 e foi estendido para Arabidopsis, algodão, trigo e milho usando vários outros sistemas de expressão de vírus, incluindo o vírus da batata X (PVX)38, o vírus do crumple da folha de algodão (ClCrV)39, o vírus do mosaico de pepino (CMV)40,41,42, vírus do mosaico de trigo chinês (CWMV)43 , e o vírus do mosaico de listras de cevada (BSMV)44,45.

A batata (solanum tuberosum) é a quarta cultura alimentar mais importante e a cultura noncereal mais cultivada noncereal no mundo principalmente devido ao seu alto valor nutricional, alta produção de energia e requisitos relativamente baixos de insumos46. Várias características da batata fazem dele uma planta modelo dicotyledonous atraente. É uma cultura poliploide propagada vegetativamente com alta taxa de cruzamento, heterozigosidade e diversidade genética. No entanto, até o momento, não há nenhum relatório caracterizando a função de miRNAs na batata usando VbMS. Aqui, apresentamos uma clonagem independente de ligadura (LIC) adaptada à batata VbMS baseada em VbMS para avaliar a função de miRNAs em plantas de batata38. Selecionamos a família miR165/166 para ilustrar o ensaio VbMS porque a família miR165/166 e seus mRNAs alvo e os fatores de transcrição de homeodomína/leu classe III (HD-ZIP III) foram amplamente caracterizados22,47,48. Os genes HD-ZIP III são os principais reguladores do desenvolvimento de meristem e polaridade de órgãos, e a supressão da função miR165/166 leva ao aumento da expressão dos genes HD-ZIP III, resultando em defeitos de desenvolvimento pleotrópico, como a redução da dominância apical e padrões aberrantes de polaridade de folhas222,35,38,41 . Os fenótipos de desenvolvimento facilmente escoráveis correlacionados com o silenciamento do miRNA165/166 permitem uma avaliação precisa da eficácia do ensaio VbMS baseado em PVX.

Neste estudo, demonstramos que o sistema VbMS baseado em PVX pode efetivamente bloquear a função de miRNAs na batata. Como o sistema de silenciamento genético induzido por vírus (VIGS) baseado em PVX foi estabelecido em várias variedades de batata49,50,51,52, essa abordagem VbMS baseada em PVX pode provavelmente ser aplicada a uma ampla gama de espécies de batata diploide e tetraploide.

Protocol

1. Cultivar plantas de batata. Propagar plantas de batata in vitro em tubos de cultura (25 x 150 mm) com mídia Murashige e Skoog (MS) mais vitamina Gamborg (mistura de sal basal de MS, vitamina Gamborg, 30 g/L de sacarose, 3,5 g/L de ágar, pH = 5,7). Coloque os tubos na sala de crescimento abaixo de 20-22 °C, 16 h de luz/8 h fotoperíodo escuro e intensidade de luz 120 μmol/m2∙s1.NOTA: Novas brotos e raízes normalmente se desenvolvem em 1-2 semanas a partir de plantas. Propagar …

Representative Results

A Figura 2 mostra as plantas de batata PVX-STTM165/166 (Katahdin) com crescimento ectópico de tecidos de folhas do lado abaxial da folha de lamina ao longo das veias. Fenótipos mais severos, como a formação de folhas em forma de trompete, também foram observados. Em contraste, não foi observada anormalidade fenotípica nas plantas de controle PVX. Esses resultados mostram que o sistema VbMS foi eficaz na supressão da função miRNA endógena em plantas de batata tetraploide e o sistem…

Discussion

Apresentamos um sistema de silenciamento miRNA baseado em PVX para caracterizar a função de miRNAs endógenos na batata, integrando o design STTM ao vetor PVX. O sistema VbMS mostrou-se eficaz no silenciamento do miRNA165/166 na batata, uma família de miRNA altamente conservada entre espécies vegetais.

A abordagem TM foi desenvolvida para interferir na expressão de miRNAs baseada em uma mímica de alvo miRNA artificial que foi projetada para criar um loop de incompatibilidade no local esp…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. Yule Liu, da Universidade de Tsinghua, por fornecer o vetor PVX-LIC. Este trabalho foi apoiado por um fundo inicial da Texas A&M AgriLife Research e do Projeto Hatch TEX0-1-9675 do Instituto Nacional de Alimentos e Agricultura do USDA para o JS.

Materials

100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter – 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S
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Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).
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