Vi presenterer en in vitro vaskulær sykdom modell for å undersøke fullblods interaksjoner med pasient-avledet endotel. Dette systemet tillater studiet av trombogene egenskaper av primære endotelceller under ulike omstendigheter. Metoden er spesielt egnet til å evaluere in situ trombogenitet og antikoagulasjonsbehandling i ulike faser av koagulasjon.
Dannelsen av blodpropper innebærer komplekse interaksjoner mellom endotelceller, deres underliggende matrise, ulike blodceller og proteiner. Endotelet er den primære kilden til mange av de store hemostatiske molekylene som kontrollerer blodplateaggregasjon, koagulasjon og fibrinolyse. Selv om mekanismen for trombose har blitt undersøkt i flere tiår, fokuserer in vitro-studier hovedsakelig på situasjoner med vaskulær skade der subendothelial matrise blir utsatt, eller på interaksjoner mellom celler med enkeltblodkomponenter. Vår metode gjør det mulig å studere interaksjoner mellom fullblod og et intakt, sammenføyd vaskulært cellenettverk.
Ved å bruke primære humane endotelceller gir denne protokollen den unike muligheten til å studere påvirkning av endotelceller på trombusdynamikk og gir verdifull innsikt i patofysiologien til trombotisk sykdom. Bruken av skreddersydde mikrofluidiske strømningskanaler gjør det mulig å bruke sykdomsspesifikke vaskulære geometrier og modellspesifikke morfologiske vaskulære endringer. Utviklingen av en trombe registreres i sanntid og kvantitativt preget av blodplateadhesjon og fibrin deponering. Effekten av endotelfunksjon i endret trombedynamikk bestemmes av postanalyse gjennom immunofluorescence farging av spesifikke molekyler.
De representative resultatene beskriver eksperimentelt oppsett, datainnsamling og dataanalyse. Avhengig av forskningsspørsmålet kan parametere for hver seksjon justeres, inkludert celletype, skjærhastigheter, kanalgeometri, medisinering og postanalyseprosedyrer. Protokollen valideres ved å kvantifisere trombedannelse på lungearterien endotelet til pasienter med kronisk tromboembolisk sykdom.
Endotelet danner det indre cellulære laget av blodkar og skiller blod fra det omkringliggende vevet. Det har blitt beskrevet som et dynamisk organ som aktivt regulerer mikromiljøet og reagerer på ytre stimuli1. På grunn av sin direkte kontakt med rennende blod, er endotelet avgjørende i kontroll av hemostase og trombose og er den primære kilden til mange av de store regulatoriske molekylene som kontrollerer blodplateaggregasjon, koagulasjon og fibrinolyse2. Friske, ikke-aktiverte endotelceller (EC) produserer flere molekyler som motvirker blodplateaktivering og forhindrer koagulasjons- og trombedannelse for å opprettholde blodstrømmen, for eksempel prostacyklin, trombomodulin eller vevsfaktorveihemmer (TFPI)2,,3. Dette forhindrer vedheft av blodplater, blodplateaggregasjon og trombedannelse. Skade eller aktivering av karveggen resulterer i en prokoagulant endotelfenotype som initierer lokalisert blodplate vedheft og koagulasjon2,,4. Ved endotelaktivering holder blodplater seg til von Willebrand Factor (VWF), et multimerisk protein som frigjøres fra EC-er, eller til eksponerte bindingssteder i den underliggende subendothelialmatrisen. Deretter starter molekylære endringer i blodplater og eksponering for vevsfaktor (TF) aktiveringen av koagulasjonssystemet, noe som induserer trombedannelse ved fibrinpolymerisering5,6. Sammen gir den resulterende blodpropp grunnlaget for sårlukking ved re-endotelialisering7. Perturbasjoner i koagulasjonssystemet kan føre til blødningsforstyrrelser, som von Willebrands sykdom, hemofili eller trombose, som ofte skyldes en dysregulert pro- og antitrombotisk balanse i endotelhemotisk vei2,3.
Prosessen med hemostase forekommer i både arteriell og venøs sirkulasjon. Mekanismene underliggende arterielle og venøse trombose er imidlertid fundamentalt forskjellige. Mens arteriell trombose, som sett i iskemisk hjertesykdom, for det meste er drevet av brudd på en aterosklerotisk plakk under forhold med høyt skjærstress, utvikler venøs trombose for det meste i fravær av endotelskade i en tilstand av stasis8,9,10. En dyp venetrombus kan embolisere og reise mot lungearteriene, hvor det forårsaker lungeemboli. Dette kan føre til kroniske vaskulære hindringer som fører til betydelig nedsatt funksjonsevne som kan fremme utviklingen av klotoniske lungesykdommer, inkludert utvikling av kronisk tromboembolisk pulmonal hypertensjon (CTEPH)11,12,13,14. CTEPH er preget av forhøyet lungetrykk på grunn av hindringer i lungearteriene av tromboembolisk materiale etter minst tre måneder med antikoagulasjonsbehandling15. I tillegg til lunge emboli, er det postulert at lunge endotelet gir et protrombotisk miljø i CTEPH som letter in situ tromboseogkroniske hindringer i lungearteriene, forårsaker økningen i blodtrykket som til slutt kan føre til hjertesvikt, hvisubehandlet 16,17.
I løpet av de siste årene har ulike studier ført til utvikling av analyser for å undersøke trombedannelse ved å måle blodplatefunksjon og koagulasjon18. Men de fleste av dem enten studere samspillet mellom fullblod med enkelt ekstracellulære matrisekomponenter som kollagen eller fibrins, eller endotelfunksjon i samspill med enkeltblodkomponenter, for eksempel endotelplatelet eller endotel-leukocyttinteraksjon 19,,20,,21,,22. Disse analysene utføres oftest med humane navlestrengendende celler (HUVEC), da disse cellene lett oppnås. Imidlertid er hemostatiske gener differensialt uttrykt over vaskulært tre, kartyper og organsystemer23,24, noe som gjør bruk av HUVECs for å representere endotelceller involvert i arteriell trombose eller lungeemboli problematisk23.
I tillegg til EC plastisitet, kan sykdomsspesifikke heodynamiske endringer og endringer i vaskulær morfologi fremme trombedannelse ved normal endotel25. Høyere skjærpriser, på grunn av lokal vasokonstriksjon eller endringer i kargeometri, for eksempel, kan føre til akutt trombedannelse, noe som forårsaker en stenose som akselererer opphør av blodstrømmen26. Bruken av skreddersydde mikroengineerte strømningskanaler gjør det mulig å spesifikt designe vaskulære geometrier som er representative for (pato)biologi. På denne måten er det mulig å studere effekten av lokale biomekaniske krefter på sunne eller syke EC27.
Det er antikoagulasjonsterapi er tilgjengelig for målretting av ulike faser og molekyler i koagulasjonskaskaden, som alle utgjør spesielle risikoer og fordeler som kan være spesifikke for visse lidelser. Tilnærmingen til sykdomsmodellering beskrevet i dette papiret er spesielt egnet til å teste effekten av ulike antikoagulasjons- og platehemmerbehandlinger på trombedynamikk.
Målet er å presentere en modell av trombose som inkluderer primære ECer, noe som gir en allsidig modell egnet for analyse av ulike former for trombose avhengig av hvilken type primære ECer som brukes. Som en illustrasjon brukte vi lungearterie endotelceller fra CTEPH-pasienter i samspill med hele humant blod som inneholder alle komponenter som er involvert i trombedannelse (blodplater, leukocytter, erytrocytter, koagulasjonsproteiner og kofaktorer). Denne tilnærmingen kan brukes i kommersielle parallelle strømningskanaler eller i skreddersydde mikrofluidiske strømningskanaler med en bestemt vaskulær design. Som sådan kan modellen til slutt brukes i studiet av trombedannelse og oppløsning, for vurdering av inflammatoriske responser i sykdomsmodellering, for platehemmende eller antikoagulasjonsterapi, og til slutt for personlig medisin.
Denne studien beskriver isoleringen av primære humane lungearterie endotelceller. For isolering av andre primære humane endotelceller refererer vi til tidligere publiserte metoder, inkludert lungemikrovaskulære endotelceller25,humane navlestrengende urinceller28, og blodsirkulasjonsende endotelkolonidannende celler Figur 1A29.
Koagulasjon er et resultat av det komplekse og timelig kontrollerte samspillet mellom endotelet og blodkomponentene. Denne in vitro-analysen presenterer en metode for å undersøke trombogene egenskaper av endotelceller i sanntid. Ulike typer primære humane endotelceller kan brukes, noe som letter in situtrombose på en orgel og pasientspesifikk måte. I denne studien illustrerte vi bruken av denne protokollen som sammenlignet trombogene egenskaper av PAECer isolert fra friske donorer versus CTEPH-pasienter. Levende trombedannelse ble studert ved perfusjon av fullblod fra friske forsøkspersoner over histaminaktivert endotel, mens effekten av et DOAC ble testet som et antitrombotisk middel.
Foruten bruk av kommersielt tilgjengelige mikrokanaler, som vist i de representative resultatene, gjør innføringen av de skreddersydde mikrofluidiske kanalene studiet av påvirkning av vaskulære geometriendringer på trombedannelse. For eksempel reduseres strømmen på et grenspunkt eller stenose resulterer i en økning i skjærstress og mer blodplateaktivering36. En betydelig begrensning av disse skreddersydde mikrofluidiske kanalene er imidlertid kravet om høye celletall for å danne et stabilt monolag av ECer som beskrevet i trinn 2.3.2. Dette kan presentere en begrensende faktor når pasientavledede celler er knappe. Styrkene til de kommersielt tilgjengelige mikroskliene er at overflatearealer er modifisert for cellekultur og vekstområder er større, og dermed tillater ECer å danne et samløpet og stabilt monolag. På den annen side vil et større overflateareal resultere i en større lumen. Ifølge Equation 1 kreverdette høyere blodvolumer for å nå lignende strømningshastigheter som i de skreddersydde mikrofluidiene.
En forbedring av denne protokollen kan være å undersøke live EC tap eller endringer i barriere integritet. EC-skader i denne protokollen måles bare på slutten av eksperimentet. For live sporing kan ECer merkes med mCherry VE-cadherin, for eksempel37. Men da dette ville trenge en svært optimalisert protokoll med effektiv virustransfeksjon, kan Electric Cell-substrat Impedance Sensing (ECIS) brukes som et alternativ til å studere endotelintegritet og barrierefunksjon38. Perfusjon over spesielle ECIS-strømningskanaler muliggjør langsgående overvåking av endotelbarriereintegritet under strømning. Disse spesifikke ECIS-funksjonene tillater parallelle målinger av endotelbarriereegenskaper og trombedannelse. Alternative måter for parallelle EC-barrieremålinger, spesielt i de skreddersydde arrayene, inkluderer bruk av fluorescerende dextrans i perfusatet, som sprer seg ut av lumen, avhengig av EC-barriereegenskapene.
En begrensning av den beskrevne protokollen er at ECer fjernes fra menneskekroppen og dyrkes på vevskulturplast, som er et stivt, kunstig substrat. Celler tilpasser seg deres biofysiske miljø. Dette kan muligens påvirke endotelresponsen på blodplateaktivering, da det er en sammenheng mellom blodplateaktivering og veggstivhet39. Til tross for disse tilpasningene til kulturplast, holder cellene sykdomsspesifikke egenskaper som kan identifiseres i direkte sammenligning med ECer avledet fra friske donorer som vist med kontroll, CTEPH-PAEC og HUVEC som utøvet forskjellige mønstre av blodplateadhesjon og fibrin deponering etter 5 min blodperfusjon.
I motsetning til andre protokoller bruker dette systemet fullblod, mens andre studerer EC interaksjon med en enkelt blodkomponent som blodplater og leukocytter19,,20,,21. Det har vært mer avanserte mikrofluidiske modeller utviklet som tillater studiet av endotelfunksjon i en vaskulær modell med en rund kargeometri og myk ekstracellulær matrise. Disse er imidlertid optimalisert med HUVECs40,41,42. Nyheten om den beskrevne protokollen er bruken av primære ECer kombinert med fullblod som bringer modellering av in situ trombose ett skritt nærmere in vivo-forhold. Etter å ha optimalisert protokollen for bruk av pasientavledede ECer og pasientavledet blod optimaliserer ytterligere sykdomsmodellering in vitro, slik at vurderingen av personlig trombedannelse og medikamentbehandling.
Den beskrevne protokollen kan brukes til å studere effekten av antikoagulasjonsbehandlinger på pasientavledede celler. Mens vi brukte dabigatran for å hemme trombedannelse, er det mulig å bruke andre antikoagulantia, som rivaroksaban, som direkte hemmer faktor Xa i koagulasjonskaskaden. Direkte blodplatehemmere som klopidogrel eller aspirin kan studeres også, da disse virker på den primære fasen av hemostase hvor blodplater binder seg til ECer. Til syvende og sist kan tromboogen kapasitet av pasientspesifikke ECer i samspill med pasientens eget blod brukes til å forutsi den personlige effekten av antikoagulasjonsbehandling på den enkelte pasient. Videre kan en knockdown av spesifikke proteiner gi ytterligere funksjonell informasjon.
Det er noen trinn i den beskrevne protokollen som er kritiske for et vellykket perfusjonseksperiment. For det første, under isolering av primære celler, er det nødvendig å få en svært ren EC-kultur. For det andre er det viktig at ECene danner et stabilt sammenføyd monolag. Hvis dette ikke er tilfelle, kan en liten endring i skjærstress forårsake endotelskade og aktivering av koagulasjonskaskaden, eller blodplater kan begynne å binde seg til kjellermembranen, noe som vil gi falske positive resultater. For det tredje er det viktig å forhindre luftbobler, da de kan skade endotelet og dermed påvirke resultatene.
Etter rekalsifisering av det citrated blod med kalsiumklorid og magnesiumklorid, er det viktig å umiddelbart starte perfusjonseksperimentet. Rekalsifisering induserer en rask respons i blodplateaktivering og trombedannelse, noe som resulterer i rask koagulasjon i prøven.
Til slutt beskriver vi en svært allsidig protokoll for å studere fullblods endotelcelleinteraksjoner under trombose.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jan Voorberg fra Institutt for plasmaproteiner, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academic Medical Center, Amsterdam, Nederland, for hans innspill i dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av den nederlandske CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] tildelt Phaedra og Reconnect-konsortiet, samt Impulse-stipendet 2018 tildelt Phaedra IMPACT-konsortiet. Disse tilskuddene inkluderer kollektiv finansiering av Dutch Heart Foundation, Dutch Federation of University Medical Centers, Nederland Organization for Health Research and Development og Royal Netherlands Academy of Sciences. Videre ble dette arbeidet finansiert av European Research Council under Advanced Grant ‘VESCEL’-programmet (Stipendnummer: 669768). XDM er finansiert av et forskningsstipend fra Institute for CardioVascular Research (ICaR-VU) ved VU University Medical Center, Amsterdam, Nederland.
20 mL syringe | BD Plastipak | 300613 | |
20X objective | Olympus | ||
2-Propanol (IPA) | Boom | 76051455 . 5000 | |
Aladdin Syringe Pump | Word Precision Instruments | AL-4000 | |
Alexa488-Fibrinogen | Invitrogen | F13191 | 15 ug/mL |
Alexa647 Goat anti Rabbit | Invitrogen | A21245 | 0.180555556 |
Biopsy punch 1 mm diameter, Integra Miltex | Ted Pella | 15110-10 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A9647 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115 | |
Calcein AM-Red | Invitrogen | C3099 | 1:1000 |
CD42b-APC | Miltenyi Biotec | 130-100-208 | 1:100 |
Citric Acid | Merck | 244 | |
Collagen Typ I | Corning | 354249 | 0,1 mg/mL |
Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish | Corning | 3295 | |
Cross-flow hood | Basan | ||
Desiccator | Duran | 24 782 69 | |
D-Glucose | Merck | 14431-43-7 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F0895 | |
Flow tubings | ibidi | 10831, 10841 | |
Gelatin | Merck | 104070 | 0.1% |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 1:1000 |
ibidi µ-Slide VI 0.4 flow chambers | ibidi | 80606 | |
ImageJ | ImageJ | v1.49 | |
KCl | Merck | 7447-40-7 | |
Lab oven | Quincy | 10GC | |
LS720 Fluorescent microscope | etaluma | LS720 | |
Luer connector | ibidi | 10802, 10825 | Male elbow connectors, and Female tube connectors |
MACS magnetic beads (anti-CD144) | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | 1:5 |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
Microscopy slides, 76 x 26 mm | Thermo Scientific | AAAA000001##12E | |
Negative photoresist, SU-8 | Microchem | ||
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Lonza | 13-114E | |
Paraformaldehyde (PFA) | Merck | 818715 | 4% PFA in PBS |
Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco | 15140-122 | 1% |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-094 | |
Plasma chamber, CUTE | Femto Science | ||
Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 | Dow | 101697 | |
sodium citrate blood collection tubes | BD Vacutainer | 363048 | |
trisodium citrate | Merck | 6448 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-045 | |
VE-Cadherin (D87F2)-XP | Cell Signaling | 2500 | 1:300 |