Vi beskriver ett protokoll för en tredimensionell samkultur modell av infekterade luftvägar, med hjälp av CFBE41o– celler, THP-1 makrofager och Pseudomonas aeruginosa, som fastställts vid luft-flytande gränssnittet. Denna modell ger en ny plattform för att samtidigt testa antibiotikaeffekt, epitelial barriärfunktion och inflammatoriska markörer.
fDrug forskning för behandling av lunginfektioner går mot prediktiva in vitro-modeller av hög komplexitet. Den mångfacetterade närvaron av bakterier i lungmodeller kan åter anpassa epitelarrangemang, medan immunceller samordnar ett inflammatoriskt svar mot bakterierna i mikromiljö. Medan in vivo-modeller har varit valet för att testa nya anti-infectives i samband med cystisk fibros, de fortfarande inte exakt efterlikna in vivo villkor av sådana sjukdomar hos människor och behandlingsresultaten. Komplexa in vitro-modeller av de infekterade luftvägarna baserade på mänskliga celler (bronkial epitelial och makrofager) och relevanta patogener skulle kunna överbrygga denna klyfta och underlätta översättningen av nya anti-infectives till kliniken. För sådana ändamål har en co-kultur modell av den mänskliga cystisk fibros bronkial epitelial cellinje CFBE41o– och THP-1 monocyte-derived makrofager har fastställts, härma en infektion i människors bronkial slemhinna av P. aeruginosa vid luft-flytande gränssnitt (ALI) villkor. Denna modell är inställd i sju dagar, och följande parametrar samtidigt bedömas: epitelial barriär integritet, makrofag transmigration, bakteriell överlevnad, och inflammation. Det föreliggande protokollet beskriver ett robust och reproducerbart system för utvärdering av läkemedelseffekt och värdsvar som kan vara relevanta för att upptäcka nya anti-infectives och optimera deras aerosolleverans till lungorna.
Pseudomonas aeruginosa är en relevant patogen vid cystisk fibros (CF) som bidrar till nedsatt lungvävnad1. Produktionen av polysackarider, såsom alginat och andra mucoid exopolysackarider, samordnar sjukdomsförloppet, vilket leder till envis bakteriell följsamhet, begränsar leveransen av antibiotika till bakterier och skyddar bakterierna mot värd immunsystemet2. Övergången av P. aeruginosa från planktonstadiet till biofilmbildning är en kritisk fråga i detta sammanhang, vilket också underlättar förekomsten av antibiotikatolerans.
I samband med CF har musen främst använts som modell. Möss, dock inte spontant utveckla denna sjukdom med införandet av CF mutationer3. De flesta av de bakteriella biofilm utveckling och läkemedel känslighet studier har utförts på abiotiska ytor, såsom Petriskålar. Detta tillvägagångssätt representerar dock inte in vivo-komplexiteten. Till exempel är viktiga biologiska hinder frånvarande, inklusive immunceller samt slemhinnan epitel. Även P. aeruginosa är ganska giftigt för epitelceller, vissa grupper har lyckats samodla en tidigare P. aeruginosa biofilm med mänskliga bronkial celler. Dessa celler härstammar från patienter med cystisk fibros med CFTR-mutation (CFBE41o– celler)4 och som tillåts bedömaantibiotikaeffekt 5 eller bedöma korrigeringen av CFTR-proteinet under infektion6. En sådan modell visade sig förbättra förutsägbarheten av läkemedelseffekt, förutom att möjliggöra karakterisering av problem med läkemedel som misslyckades i senare faser av läkemedelsutveckling7.
I lungan utsätts dock slemhinnans epitel för luft. Dessutom immunceller som finns i luftvägarna, som vävnad makrofager, spelar en viktig roll mot inhalerade patogener eller partiklar8. Makrofager migrera genom de olika cellskikten för att nå bronkiallumen och bekämpa infektionen. Vidare, inandningsläkemedel måste också klara av förekomsten av slem som en ytterligare icke-cellulära inslag av pulmonell luft-blod barriär9. Flera komplexa tredimensionella (3D) in vitro-modeller har faktiskt utvecklats, som syftar till att öka in vivo relevans. Samkultur system inte bara öka komplexiteten i in vitro-system för läkemedelsupptäckt men också göra det möjligt att studera cell-cell interaktioner. Sådan komplexitet har tagits upp i studier om makrofag migration10, frisättningen av antimikrobiella peptider av neutrofiler11, rollen av slem i infektion9, och epitelial cell reaktion på överdriven skada12. Men en pålitlig CF-infekterade in vitro-modell som har den genetiska mutationen i CF, som utsätts för luften (ökad fysiologiska tillstånd), och integrerar immunceller saknas fortfarande.
För att överbrygga denna klyfta beskriver vi ett protokoll för stabil mänsklig 3D-samkultur av de infekterade luftvägarna. Modellen är konstituerad av mänskliga CF bronkial epitelceller och makrofager, infekterade med P. aeruginosa och kan representera både en diffusional och immunologiska barriär. Med målet att testa anti-infectives på någorlunda hög genomströmning, var denna samkultur etablerad på permeabla filtermembranet av väl platta skär, med hjälp av två mänskliga cellinjer: CFBE41o– och THP-1 monocyt-härledda makrofager. Dessutom, för att så småningom studera nedfallet av aerosolized anti-infectives13, modellen fastställdes vid luft-flytande gränssnittet (ALI) snarare än flytande täckta villkor (LCC).
Som vi rapportera här, denna modell gör det möjligt att bedöma inte bara bakteriell överlevnad på en antibiotikabehandling utan också cell cytotoxicitet, epitelial barriär integritet, makrofag transmigration och inflammatoriska svar, som är väsentliga parametrar för läkemedelsutveckling.
Detta protokoll kombinerar två relevanta celltyper för inhalationsterapi av lungvägarna: makrofager och CF bronkial epitel. Dessa celler är seedade på motsatta sidor av genomsläppliga stödinsatser, vilket möjliggör cellexponering för luft (kallas luft-flytande gränssnitt (ALI) villkor). Denna samkultur av värdceller är därefter infekterad med P. aeruginosa. Båda värd cellinjer är av mänskligt ursprung: epitelceller representerar cystisk fibros bronkial epitel, med en mutation på CF-kanalen (CFBE41o–), och THP-114 celler är en väl karakteriserad makrofag-liknande cellinje. Ett konfluentepitelskikt får först bildas på den övre sidan av brunnsplåtsinsatser innan de makrofagliknande cellerna tillsätts till det motsatta facket. När samkulturen är etablerad vid ALI, systemet är inokuleras med P. aeruginosa vid den apikala sidan. Detta infekterade co-culture system används sedan för att bedöma effekten av ett antibiotikum, t ex tobramycin. Följande end-points analyseras: epitelial barriärintegritet vad gäller transepitelialt elektriskt motstånd (TEER), visualisering av cell-cell- och cell-bakterieinteraktioner genom confocal laserscanningsmikroskopi (CLSM), bakterieöverlevnad genom räkning av kolonibildande enheter (CFU), värdcellsöverlevnad (cytotoxicitet) och cytokinfrisättning.
Detta dokument beskriver ett protokoll för en 3D-samkultur av de infekterade luftvägarna, som utgörs av den mänskliga cystisk fibros bronkial epitelial cellinje CFBE41o- och den mänskliga monocyte-härledda makrofag cellinje THP-1. Protokollet tillåter bedömning av epitelial barriär integritet, makrofag transmigration, bakterier överlevnad, och inflammation, som är viktiga parametrar när man testar läkemedelseffekt och host-svar samtidigt. Nyheten i modellen ligger inom införlivandet av epitelceller (dvs. hu…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete fick finansiering från EU:s HORIZON 2020-program för forskning, teknisk utveckling och demonstration enligt bidragsavtal nr 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA – Design, and Development of advanced Nanomedicines to overcome Biological Barriers and to treat severe diseases. Vi tackar Dr Ana Costa och Dr Jenny Juntke för det stora stödet för utvecklingen av samkulturen, Olga Hartwig, för den vetenskapliga illustrationen, Anja Honecker, för ELISA analyser, Petra König, Jana Westhues och Dr Chiara De Rossi för stöd på cellkultur, analys och mikroskopi. Vi tackar också Chelsea Thorn för korrekturläsning av vårt manuskript.
Accutase | Accutase | AT104 | |
Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | – | |
CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
CFBE41o– cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
Petri dishes | Greiner | 664102 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |