성인 마우스및 쥐 심근세포의 격리, 트랜스페션 및 장기 문화
Summary
여기서, 우리는 성인 마우스와 쥐 심근세포의 격리, 형질 전환 및 장기 문화에 대한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
성인 포유류 심근세포(CM)의 전 생체 배양은 심장 생물학의 체외 연구를 위한 가장 관련성이 있는 실험 시스템을 제시합니다. 성인 포유류 CM은 최소한의 증식 능력을 가진 말기 분화 세포입니다. 성인 CM의 미토틱 후 상태는 심근세포 세포 주기 진행을 제한할 뿐만 아니라 CM의 효율적인 배양을 제한합니다. 더욱이, 성인 CM의 장기 배양은 CM 증식 및 유전자 발현의 분석과 같은 많은 연구 결과에 필요합니다.
마우스와 쥐는 심근세포 분리에 사용되는 두 가지 가장 바람직한 실험실 동물이다. 쥐 CM의 장기 문화가 가능하지만 성인 마우스 CM은 사망에 취약하며 정상적인 조건에서 5 일 이상 배양 할 수 없습니다. 따라서 성인 뮤린 CM에 대한 세포 격리 및 장기 배양 프로토콜을 최적화해야 하는 중요한 필요성이 있습니다. 이 수정된 프로토콜을 사용하면 성인 마우스와 쥐 CM을 20일 이상 성공적으로 분리하고 배양할 수 있습니다. 더욱이, 고립된 CM의 siRNA 경질 효율은 이전 보고에 비해 현저히 증가된다. 성인 마우스 CM 절연의 경우, 랑엔도르프 관류 방법은 최적의 효소 용액과 완전한 세포 외 매트릭스 해리를위한 충분한 시간으로 활용됩니다. 순수한 심실 CM을 얻기 위해, 모두 분리 및 도금을 진행하기 전에 해부 및 폐기되었다. 세포는 효율적이고 신속한 부착을 허용 라미닌 코팅 플레이트에 분산되었다. CM은 siRNA 경질 전에 4-6 h에 정착할 수 있었습니다. 배양 매체는 20일마다 24시간마다 리프레시되었고, 그 후, CM은 KI67과 같은 세포 주기의 트로포닌 및 마커와 같은 심장 특정 마커에 대해 고정및 염색되었다.
Introduction
심장 질환은 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 심장 상해의 거의 모든 모형은 성인 심근세포 (CMs)의 중요한 손실 귀착됩니다. 성인 포유류 심장은 성인 CM1의노화 특성으로 인해 심장 손상을 복구 할 수 없습니다. 따라서, 성인 포유류 심장에 어떤 모욕은 감소 심장 기능 및 심부전으로 이끌어 내는, CMs의 영원한 손실 결과로 초래됩니다. 성인 포유동물과 달리, 제브라피쉬와 새로운 심장과 같은 작은 동물은 기존의 CM 증식2,,3,,4를통해 심장 손상을 재생할 수 있다. 전 세계적으로 확산 및 비 증식 접근 방식을 통해 심장 부상에 대한 새로운 치료 개입을 찾기 위한 노력이 진행중입니다. 지난 수십 년 동안, 유전 마우스 모델의 다양한 유형은 심장 부상과 수리를 연구하기 위해 개발되었습니다. 그러나 생체 내 동물 모델을 사용하는 것은 이차 효과로부터 세포 자율 메커니즘을 해독하기 위한 추가적인 복잡성으로 고가의 접근법이 계속되고 있다. 게다가, 생체 내 시스템은 CM에서 심장 보호 신호를 유도하는 약리학적 개입의 CM 특이적 효과를 분석하기 가 어렵습니다.
또한 CM 증식 분석을 수행하기 위해서는 성인 CM의 장기적인 문화가 필요합니다. CM 증식 분석법은 세포가 세포 주기로 유도되고 그 후에 정확한 데이터를 얻기 위하여 세포에 대한 최소 4-5 일이 필요합니다. 또한, 전기생리학 연구를 위해 고립된 CM을 활용하는 연구, 약물 스크리닝, 독성 연구, Ca++ 항상성 연구는 모두 개선된 배양 시스템5,,6,,7이필요하다. 더욱이, 최근 연구는 CM (심장 카인)8,,9에서분비 된 사이토카인의 심장 보호 의의를 보여줍니다. 심장 수리 및 재생 중에 이러한 심장 키인의 치료 역할 및 분자 메커니즘을 조사하기 위해서는 장기간 문화가 필요합니다.
성인,쥐 CM은 체외시스템(10,11,12)에서단세포 절연 및 장기 배양을 충분히 견고하다., 그러나, 성인용 마우스 CM은 쥐 CM13로는불가능한 다양한 혁신적인 분석의 설계 및 실행을 허용하는 다양한 유전자 변형 마우스 모델의 가용성으로 인해 체외 분석에 큰 관심을 갖는다. 성인 쥐 CM 격리와는 달리, 성인 마우스 심혼에게서 단세포 정지를 얻는 것은 아주 도전적이고, 문화에서 성인 마우스 CMs의 장기 문화는 더욱 도전적입니다.
랑엔도르프 시스템을 이용한 마우스및 쥐 심혼으로부터의 성인 CM 절연은 이전에 CM 기능5,,14,,15를연구하기 위해 설립되었다. 여기서, 우리는 쥐와 마우스 둘 다에서 성인 CM 절연을 위한 프로토콜뿐만 아니라, 격리된 세포의 수정된 장기 배양, 형질, CM 증식을 상세히 기술했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포 특정 기계학 연구를 수행하기 위해 성인 심근 세포 격리 및 장기 배양을위한 프로토콜을 수립해야 하는 중요한 필요가 있습니다. 성인 CM 격리 프로토콜에 대해 논의하는 보고서는 몇 가지뿐이며, 그 중 더 적은 수의 성인 마우스 CM15,,16,,17의장기 배양에 사용된다. 성인 쥐 CM은 성인 마우스 CM10,,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 병리학 및 실험실 의학의 학과에서 자금 지원, 신시내티 대학, 의과 대학, 박사 오누르 카니시카크; 국립 보건원(R01HL148598)에서 오누르 카니시카크 박사에게 교부금. 오누르 카니시카크 박사는 미국 심장 협회 경력 개발 상(18CDA34111117)의 지원을 받고 있습니다. 퍼웨즈 알람 박사는 미국 심장 협회 박사 후 보조금(AHA_20POST35200267)의 지원을 받고 있습니다. 말리나 J. 아이비 박사는 NIH T32 교부금(HL 125204-06A1)의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
References
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