Vi beskriver en teknik til profilering af mikroRNA’er i tidlige museembryoner. Denne protokol overvinder udfordringen med lavt celleinput og lille RNA-berigelse. Denne analyse kan bruges til at analysere ændringer i miRNA udtryk over tid i forskellige celle slægter af den tidlige mus embryo.
MicroRNAs (miRNAs) er vigtige for den komplekse regulering af celle skæbne beslutninger og udviklingsmæssige timing. In vivo-undersøgelser af miRNA’ernes bidrag i den tidlige udvikling er teknisk udfordrende på grund af det begrænsende celletal. Desuden kræver mange tilgange en miRNA af interesse, der skal defineres i analyser såsom nordlige blotting, microarray, og qPCR. Derfor er udtrykket af mange miRNA’er og deres isoforms ikke blevet undersøgt i den tidlige udvikling. Her demonstrerer vi en protokol for små RNA-sekventering af sorterede celler fra tidlige museembryoner for at muliggøre relativt upartisk profilering af miRNA’er i tidlige populationer af neurale crestceller. Vi overvinder udfordringerne ved lav celleinput og størrelsesvalg under biblioteksforberedelse ved hjælp af forstærkning og gelbaseret rensning. Vi identificerer embryonale alder som en variabel regnskabsmæssig behandling af variation mellem replikater og fase-matchede museembryoner skal anvendes til præcist profil miRNA’er i biologiske replikater. Vores resultater tyder på, at denne metode kan anvendes bredt til at profilere udtrykket af miRNA’er fra andre slægter af celler. Sammenfattende kan denne protokol bruges til at undersøge, hvordan miRNAs regulere udviklingsprogrammer i forskellige celle slægter af den tidlige mus embryo.
Et centralt spørgsmål om udviklingsbiologi er, hvordan en enkelt udifferentieret celle kan give anledning til en hel organisme med mange komplekse celletyper. Under embryogenese bliver cellernes udviklingspotentiale gradvist begrænset, efterhånden som organismen udvikler sig. Et eksempel er den neurale crest afstamning, som gradvist adskiller sig fra en multipotent celle befolkning i forskellige terminal derivater, såsom perifere neuroner, glia, kranieknogle, og brusk. Neurale crest celler er angivet fra ectoderm under gastrulation og derefter gennemgå en epitel til mesenkymale overgang og migrere gennem fosteret til diskrete steder i hele kroppen, hvor de vil terminalt differentiere1. Årtiers arbejde har afdækket en transskriptionel gen reguleringsnetværk, men langt mindre er kendt om mekanismerne i post-transskriptionel regulering, der styrer timingen af neurale våbenskjold udvikling.
Tidligere arbejde tyder på, at microRNAs (miRNAs) undertrykker genekspression for korrekt udviklingstiming og celle skæbnebeslutninger 2,3,4,5,6. Undersøgelser af miRNA’er i neurale våbenskjold udvikling har i vid udstrækning fokuseret på senere stadier af kraniofacial udvikling. For eksempel, miR-17 ~ 92 og miR-140 er afgørende for palatogenesis under kraniofacial udvikling i mus og zebrafisk,henholdsvis 7,8. Bidraget fra miRNA’er til de tidligste neurale crest skæbne beslutninger af fosteret er ikke blevet grundigt undersøgt. Undersøgelser af miRNA’er i beslutninger om tidlig skæbne er blevet begrænset af tekniske udfordringer såsom det lave celletal, der er til stede i tidlige embryoner.
MiRNA’er er blevet profileret in vitro fra cellelinjer ved hjælp af embryoidorganer på forskellige stadier af differentiering til at modellere tidlig museudvikling9. Undersøgelsen af små RNA’er in vivo under udviklingen af et tidligt pattedyr har været relativt begrænset. Tidligere metoder til profil miRNA’er har ført til bias som en kendt sekvens bruges til at analysere udtryk for en bestemt miRNA i metoder som qPCR, microarrays, og nordlige blots10. Næste generation sekventering og stadig bedre molekylære værktøjer nu giver mulighed for relativt upartisk analyse af miRNA udtryk til at studere deres bidrag til tidlig pattedyr udvikling og celle skæbne beslutninger.
Her rapporterer vi en teknik til at høste og sekvens små RNA’er udtrykt i neurale crestceller fra tidlige museembryoner, der spænder over gastrulation (E7.5) til begyndelsen af organogenese (E9.5). Denne teknik er ligetil og kombinerer afstamningssporing, cellesortering og gelbaseret størrelsesvalg for at forberede små RNA-sekventeringsbiblioteker fra et minimalt antal celler til næste generations sekvensering. Vi fremhæver vigtigheden af streng somit fase matchning af embryoner til at løse 6-timers tidsintervaller for at opnå et omfattende overblik over miRNA’er under de hurtige ændringer i den tidlige udvikling. Denne metode kan anvendes i vid udstrækning på genetiske og udviklingsmæssige undersøgelser og undgår sammenlægning af embryoner. Vi beskriver en måde at overvinde udfordringer af nuværende metoder såsom miRNA berigelse ved hjælp af gel-baseret rensning, bibliotek kvantificering, og minimere bias indført fra PCR. Denne metode er blevet brugt til at identificere miRNA udtryksmønstre over tid for at undersøge, hvordan miRNAs styrer udviklingstids timing i den neurale crest afstamning af museembryoner.
Udviklingsprocesser kan gå hurtigt, og celler gennemgår mange sekventielle specifikationer, således at fange et omfattende overblik over miRNA’er, der bidrager til tidlige skæbne beslutninger, mere specifik iscenesættelse er nødvendig end den udbredte halvdags stigning. En nylig undersøgelse har udført RNA sekventering fra Theiler fase 12 embryoner, der spænder fra at have 3 til 6 somites11. Vi finder, at i løbet af denne periode, de neurale crest celler er angivet (3 somitter af alder), delaminat (4 somitter af alder), og migrere (5-6 somitter af alder). Vi finder også, at ud over Cre-driver bruges til afstamning sporcellepopulationer, alder er den største kilde til variation mellem biologiske prøver, og kun somit matchede embryoner bør betragtes som replikater. Dette bør også tages i betragtning, når transgene embryoner sammenlignes med kontrol af vilde typer.
Tidligere metoder til profil miRNA’er under den tidlige udvikling har anvendt mellem 10-100 ng RNA-input til små RNA-sekvenseringsbibliotekspræparat og har samlet flere embryoner i en prøve13,14. Vi demonstrerer RNA isolation og bibliotek forberedelse fra en enkelt E7.5 embryo eller fra sorteret neurale crest celler på E8.5 og E9.5 ved hjælp af ca 100 ng af samlede RNA som input. Når der dissociating embryoner til sortering, bør man passe på at se dissociation under et mikroskop og slukke reaktionen for at observere, når enkelte celler er opnået. Vi finder, at dissociation af kranieregionen E8.5-E9.5 embryoner er næsten øjeblikkeligt med blid manuel pipettering som beskrevet i protokollen. For større væv og stadig ældre embryoner kan dissociationstiden være længere afhængigt af den del af fosteret, der adskilles. For E7.5-E9.5-embryoner er klumper af celler let synlige under mikroskopet, og dissociationen bør fortsætte, indtil der ikke er flere klumper synlige. Enkelte celler er synlige i opløsning, hvis du justerer fokus gennem løsningen i din brønd overalt fra 5-10x. Tidligere metoder sorterer celler direkte i lysisbuffer for RNA-sekvensering for at forberede bulk-RNA fra et lavt antal celler14. Her sorterer vi direkte ind i RNA-ekstraktionslyis-opløsningen, så RNA kan isoleres, inden biblioteksforberedelsen påbegyndes. Brug af minikolonner med 11 μL elueringsvolumen tilladt for en tilstrækkelig høj RNA-koncentration, således at en enkelt RNA-prep kunne deles mellem lille RNA- og masse-RNA-sekvensering.
En aktuel begrænsning af de fleste små RNA sekventeringsmetoder er PCR forstærkning af konverterede cDNA. Vores metode ikke overvinde denne begrænsning, men vi var i stand til at minimere antallet af PCR cykler fra 25-maksimum anbefales ned til 16 cykler. Denne reduktion i forstærkning mindsker kunstig forstærkning bias indført ved PCR. En anden kilde til bias er ligation af adaptere, hvor det er kendt, at specifikke sekvenser placeret i enderne af adaptere og miRNAs kan ligate sammen med større effektivitet end andre sekvenser. For at undgå dette har de adaptere, der anvendes i denne protokol, 4 tilfældige baser indarbejdet i slutningen af hver adapter for at forhindre bias i ligationsreaktioner. Derudover er et andet almindeligt problem den mængde adapterdæmpere, der dannes, når RNA-indgangen er lav. Biblioteket forberedelse kit indeholder trin til at reducere adapter dimer dannelse såsom adapter inaktivering og perle oprydninger til at fjerne overskydende adaptere efter hver ligation. Vi har også fortyndet 3 ‘og 5’ 4N adaptere med 1 / 4 for at reducere mængden af adapter dimer, der kan danne. Vi fandt, at når de ikke fortyndes, de 130 bp band intensitet øger gør det vanskeligt at skelne fra de 150 bp band, der indeholder de ønskede små RNA biblioteker på en gel.
En anden aktuel udfordring med at udarbejde sekventeringsbiblioteker er den nøjagtige kvantificering af produktet før sekvensering. Vi har konstateret, at forskellige metoder giver varierende resultater på samme bibliotek. Vi foreslår, at forskerne bruger flere metoder til kvantificering for at få en nøjagtig vurdering af koncentration.
Denne protokol kan anvendes bredt på genetiske, udviklingsundersøgelser eller andre anvendelser, hvor RNA høstes fra et lavt antal celler. Denne fremgangsmåde forenkler tidsmæssige undersøgelser ved at undgå sammenlægning af embryoner og kan let anvendes på både ikke-sorterede og sorterede celler.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev støttet af Andrew McDonough B+ Foundation og NIH (R01-HD099252, R01-HD098131. R.J.P. er en CPRIT Scholar i Cancer Research (RR150106) og V Scholar in Cancer Research (V Foundation). Forfatterne vil også gerne anerkende Cytometri og Cell Sortering Core på BCM for at levere udstyr, der er nødvendige for dette projekt.
#5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |