자기 측정을 사용하여 화학적으로 합성된 산화철 나노 입자의 세포 통합 및 후속 생분해를 모니터링합니다.

요약

산화철 나노입자는 비수성 솔 젤 시술을 통해 합성되고 음이온 짧은 분자 또는 폴리머로 코팅된다. 인간 줄기 세포 내부의 자기 나노 입자의 통합 및 생체 변환을 모니터링하기 위한 자기 측정의 사용은 진동 시료 자력계(VSM)를 사용하여 입증된다.

초록

산화철로 만든 마그네틱 나노입자는 세포에서 종종 내면화된 다음 그 안에 남겨지는 광범위한 생물 의학 응용 분야에 대한 특이한 관심을 제시합니다. 한 가지 과제는 안정적이고 정밀한 방법론으로 세포 내 환경에서 자신의 운명을 평가하는 것입니다. 본원에서, 우리는 자기 모멘티브를 측정하여 세포 내자기 나노 입자의 무결성을 정확하게 정량화하기 위해 진동 시료 자력계(VSM)의 사용을 소개합니다. 줄기 세포는 먼저 자기 나노 입자의 두 가지 유형으로 표시; 나노 입자는 빠르고 효율적인 마이크로파 기반의 비수성 솔 젤 합성을 통해 생성되는 동일한 코어를 가지며 코팅이 다릅니다: 일반적으로 사용되는 구연산 분자는 폴리아크릴산과 비교된다. 3D 세포-스페로이드의 형성은 원심분리를 통해 달성되고 이러한 스페로이드의 자기 모멘트는 VSM과 다른 시간에 측정된다. 얻어진 모멘트는 나노입자의 무결성의 직접적인 지문이며, 나노입자 분해를 나타내는 값이 감소합니다. 두 나노 입자의 경우 자기 모멘은 배양 시간이 지남에 따라 감소하여 생분해를 드러냅니다. 구연산과 비교했을 때 폴리아크릴산 코팅의 보호 효과도 나타난다.

서론

광범위한 생체 의학 응용 분야에 대한 산화철 나노 입자의 자기 기능에 대한 관심이 증가합니다. 자기 공명에 대한 그들의 반응은 자기 공명 화상 진찰을 위한 믿을 수 있는 조영제를 만듭니다 (MRI), 자기 나노 입자로 표지된 세포가 이식^1다음생체내에서 추적될 수 있는 재생 의학에서 이점. 자기장을 사용하여, 세포는 또한 거리에서 유도 될 수있다; 이러한 방식으로, 셀룰러 스페로이드^2,3,링^4,또는 시트^5는 자기적으로 설계될 수 있으며, 또한 원격으로^자극6,비계없는 조직의 개발에 있는 자산이다. 이들 나노입자에 대한 가능성의 범위는 또한 약물 전달 시스템^7,8 및 자기 및 광유도 열 처리를 포함하여 암세포를 죽이는^9,10,11을포함한다. 이러한 모든 응....

프로토콜

1. 자기 나노 입자의 합성

1. 코어 합성 – 전자레인지 지원
   1. 용해 400 철 (III) 아세틸 레이스토네이트의 mg (>99.9%) 10mL의 벤질 알코올(BA, 99.8%)에서 30mL 단파 유리 유리 바이알 내에서.
   2. 서스펜션의 온도를 20분(11.25°C/min의 속도로) 250°C로 높이고 전자레인지 반응기를 사용하여 30분 동안 250°C로 유지한다.
   3. 벤질 알코올에 매달린 결과 나노입자를 유리 유리병으로 옮기고 30분 동안 네오디뮴 자석을 사용하여 나노입자를 분리한다.
   4. 이전 100mL 유리 바이알에서 디클로로메탄 10mL, 수산화나트륨 1M, 에탄올, pH 7물(3회)으로 침전물을 세척하여 나노입자를 펠릿화하고 상퍼나탄을 제거한다.
   5. 1M 염산을 사용하여 물에서 나노 입자 현탁액을 pH 2로 조정한 다음 100 kDa 초원심 필터에서 100 kDa 초원심 필터에서 10 분 동안 2,200 x g로 원심분리기를 조정합니다.
   6. 여과를 제거하고,^10-2M 염산의 12mL를 나노입자 용액에 넣고 원심분리기는 100kDa 초원심 필터에서 10분(3회)에 2,200xg로 첨가한다. 그런 다음 코팅 전에^10-2M....

결과

전자레인지 보조 합성을 사용하여, 단면 8.8 ± 2.5 nm 코어 크기를 가진 자기 나노 입자가 구연산 또는 PAA(도1A)로생성되고 코팅된다. 줄기세포는 30분 동안 주어진 농도로 배양 배지에 분산된 이러한 나노입자로 배양되어 세포 내분(도1B)내내내세포 및 감금을 초래한다. 자기 줄기 세포는 그 때 매체에서 중단되고, 원심분리되고, 형성된 세포 펠릿은 21일까지 배양된다(도1C). 얻어진 스페로이드는 생물학적 과정을 중지하는 것과 같이 고정되고 VSM을 통해 측정될 때까지 PBS에 보관됩니다.

첫째, 나노입자 용액의 자기 모멘트는 VSM을 사용하여 측정된다: 7 μg의 철을 함유하는 나노입자 수성 분산의 10 μL이 측정되고, 얻어진 곡선은 도 2A에표시된다. 이.......

토론

빠르고 효율적인 마이크로파 기반 합성을 사용하여 자기 나노 입자는 제어 된 크기로 쉽게 합성 할 수 있으며 주어진 분자로 더 코팅 할 수 있습니다. 중요한 단계는 작은 분산을 유지하기 위해 진공 상태에서 철소금과 벤질 알코올을 비축하는 것입니다. 벤질 알코올은 용매와 리간드로 동시에 작용하여 추가 리간드 없이 는 교정된 베어 리산화물을 직접 얻을 수 있습니다. 나노 입자가 물에 전달 된 후 벌거 벗은 자기 나노 입자는 쉽게 리간드의 큰 다양한 코팅 될 수있다. 이러한 코팅은 세포 내재화에 영향을 미칠 수 있는 나노입자 및 나노입자 세포 상호작용 특성을 부여하며, 생체 의학 응용에 최소한의 내재화로 엄격하게 제어되어야 하는 파라미터는 세포에 손상을 줄 수 있고 잠재적으로 세포독성^{발생(31)을}발생시킬 수 있다. 자기 측정은 셀룰로에서 자기 나노 입자의 운명뿐만 아니라이 내산화를 평가하는 강력한 도구입니다. 자기 나노 입자를 줄기 세포로 통합하면, 스페로이드는 간단한 원심분리를 통해 형성될 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.05 % Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
합성 용 벤질 알코올	Sigma Aldrich	8.22259
Dexamethasone	Sigma	D4902	에탄올 100 %에 희석 된 1mM 원액을 준비하고 -20 °C에서 보관하십시오. C
디클로로메탄 ≥ 99% 안정화, GPR RECTAPUR	VWR Chemicals	23367
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	피루브산 나트륨 없음, HEPES
에탄올 절대	없음 VWR	20821.310
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-106
포르말린 용액 10% 중성 완충	시그마	HT5012
염산, 1.0N 표준화 용액	Alfa Aesar	35640
철(III) 아세틸아세토네이트(> 99.9%)	Sigma Aldrich	517003
ITS 프리믹스 범용 배양 보조제(20x)	Corning	354352
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	에 희석된 새로운 농축 용액(25mM)을 준비합니다.
	Sigma	P5607	증류수에 희석된 175mM 원액을 준비하고 4°C에서 보관합니다. C
중간엽 줄기세포(MSC)	Lonza	PT-2501
단파 유리 바이알	Anton Paar	82723_us
마이크로파 반응기	Anton Paar	Monowave 300
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	완전한 배지의 경우 제공된 BulletKit(혈청, 글루타민 및 항생제 포함)을
CaCl2 w/o CaCl2 w/o MSCGM 배지 PBS에 추가합니다. o MgCl2	Life Technologies	14190-094
페니실린(10.000U/mL)/스트렙토마이신(10.000&마이크로; g/mL)Life	Technologies	15140-122
폴리(아크릴산, 나트륨염)	Sigma Aldrich	416010	MW = 1200 g/mol
RPMI 매체 1640, 글루타민 없음	Life Technologies	31870-025	피루브산 나트륨 없음, HEPES 수
산화나트륨 없음, 1.0N 표준화 용액	Alfa Aesar	35629
피루브산 나트륨 용액 100mM	시그마	S8636
멸균 원추형 원심 분리기 튜브	Falcon	352097	15 mL 튜브
트립신 -EDTA (0.05 %), 페놀 레드	Thermo Fisher Scientific	25300054
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	증류수에 희석 한 1M 원액을 준비하고 4°C에서 보관하십시오. C
Tri-Sodium Citrate Dihydrate, 분석을 위한 인증된 AR	Sigma Aldrich	10396430
Ultra 원심 필터	Amicon	AC S510024

증류수 L-Proline