多アドレス可能なゲノム積分色(MAGIC)マーカーを皮質マウスアストロサイトに個別化する子宮内電気的
Summary
アストロサイトは大脳皮質を均一にタイル化し、複雑な形態の分析を細胞レベルで困難にします。ここで提供されるプロトコルは、子宮内のエレクトロポレーションに基づく多色標識を使用して、皮質アストロサイトを単一にし、ユーザーフレンドリーな画像解析パイプラインでボリュームと形態を分析します。
Abstract
マウス大脳皮質に位置する原質星血球(PrA)は、しっかりと並置され、成人期に明らかに連続した三次元マトリックスを形成する。これまでのところ、免疫染色戦略はそれらを選び出して、成熟した動物および皮質形成の過程でそれらの形態をセグメント化することはできません。皮質PrAは、後側のパリウムに位置する前駆物質に由来し、統合ベクターの子宮エレクトロポレーションで容易に標的化することができる。これらの細胞に対して、ピギーバク/Tol2転位とCre/lox の組み換えによって特定の細胞内区画に対処された明確な蛍光タンパク質(青、シアン、黄、赤)を表すマルチアドレス可能なゲノム統合色(MAGIC)マーカー戦略でこれらの細胞にラベルを付けるプロトコルが提示されます。この多色の運命マッピング戦略は、神経新生の開始前にカラーマーカーの組み合わせを持つその場で近くの皮質前駆物質をマークし、個々の細胞レベルで胚性から成体段階まで、アストロサイトを含む子孫を追跡することを可能にする。マルチアドレス可能なゲノム積分カラーマーカー(MAGICマーカーまたはMM)によって提供される電気ポレートベクターと色コントラストの濃度を調整することによって達成される半スパース標識は、アストロサイトを個別化し、その緻密な解剖学的配置にもかかわらず、その領土と複雑な形態を選び出すことを可能にする。ここでは、エレクトロポレーション手順の詳細、共焦点顕微鏡によるマルチチャネル画像スタックの取得、および実験者が個々のPrA量と形態を評価することを可能にするコンピュータ支援3次元セグメンテーションを含む包括的な実験ワークフローを提示します。要約すると、MAGICマーカーのエレクトロポレーションは、多数のアストロサイトを個別にラベル付けし、異なる発達段階で解剖学的特徴にアクセスするための便利な方法を提供します。この技術は、トランスジェニックレポーターラインを持つ複雑な十字に頼ることなく、様々なマウスモデルにおける皮質アストロサイト形態学的特性を分析するのに有用である。
Introduction
アストロサイトは脳の発達と生理学の中で多くの重要な機能を果たします。栄養摂取や血流を調節する血液脳関門での役割のほかに、ニューロンの活動や行動を変えることができる神経調節薬を産生しながら、シナプス形成と機能に積極的に寄与する。さらに、アストロサイト機能障害は、様々な神経障害3に寄与する。大脳皮質に位置するアストロサイトは、神経細胞プロセスとの広範な接触を可能にする精巧な形態を示す。これらの接触は、回路機能に必須であり、また、細胞接着タンパク質4を介してアストロサイト形態形成およびシナプト生成を制御する。神経科学者は、関心のある神経学的モデルにおけるアストロサイトの発達と形態形成を調査するための便利で堅牢なツールを必要としています。しかし、近隣に対するアストロサイトの接近と均一な三次元タイリングにより、皮質アストロサイトを単一にし、免疫マーカーを使用してその形態を包括的に評価することは困難です。
現在、2つの主要な遺伝子工学戦略は、その際の皮質アストロサイトの標識と個別化を可能にする:トランスジェニックマウスラインでのまばらなレポーター活性化またはレポータープラスミドのエレクトロポレーションを用いた体細胞トランスジェネシス。最初の戦略は、タモキシフェン送達時にアストロサイトで特異的に活性化されたクレリコンビナーゼの誘導可能な形態を発現するマウスでフロクスされたレポーターマウスラインを繁殖させることに依存する(例えば、Aldh1l1-CreERT25)。この戦略には、いくつかの欠点があります。まず、トランスジェニックマウスの繁殖には多数の動物が必要であり、多重アッセイは典型的には、皮質アストロサイトの十分にまばらな標識を提供するためにタモキシフェンの適切な用量を決定するために必要である。目的の遺伝的マウスモデルで皮質アストロサイト表現型を分析するには、さらに多くの繁殖とマウスの消費が必要になります。さらに、子宮タモキシフェン注射では分化を妨げることが知られており、この戦略はアストロサイトの初期段階の研究に適用することが困難である。インビボDNAエレクトロポレーションは、動物の最小数6に依存する代替タモキシフェンフリー戦略である。胚期または出生後の段階で行われるこのアプローチは、げっ歯類の側腹腔にレポータープラスミドを注入し、続いて細胞膜に毛穴を作る電気パルスを注入することで構成され、DNAが心室を裏打ちする前駆細胞に入ることを可能にする。続いて、電気ポレートされたプラスミドによって運ばれるレポータートランスジーンは、標的細胞機械によって処理され、7を発現する。2つのエレクトロポレーション方法は、以前にマウス皮質アストロサイトにラベルを付けるために説明されている:1)早期出生後段階で1-2単色エピソードレポータープラスミドのエレクトロポレーションに依存するエレクトロポレーション(PALE)による出生後アストロサイトラベリング。2)複数の単色統合レポータープラスミド8、9、10の子宮エレクトロポレーション(IUE)に基づくStarTrack戦略。これら2つの技術は、効率的に大脳皮質にPrAを標識するが、彼らはまた、いくつかの制限を提示する。それらの初期バージョンでは、両方の方法は、アストロサイトの発現を駆動するためにグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーターに依存しており、これは、通常の安静時PrA11,12よりも強くGFAPを発現するピアルおよび反応性アストロサイトに対してラベリングを偏らせる可能性がある。PALEに関しては、早期生まれのPrA(または初期の剥離前駆体から生じるもの)の標識を防ぐエレクトロポレーションの後期段階と、アストログリア開発の初期段階の分析、およびPrAが出生後13週目の間に受ける大規模な分裂の間に連続した分裂を通じて希釈されるエピソームベクターの使用である。PALEとは対照的に、StarTrackは、PrAへの胚性および出生後前駆物質の両方の寄与を追跡することを可能にする統合レポータープラスミドの胚エレクトロポレーションに基づいています。ユビキチンCプロモーター(UbC-StarTrack)に依存する更新されたStarTrackスキームは、神経前駆物質15、16、17の神経およびグリア降下(アストロサイトを含む)の両方における蛍光レポーターのより広い発現を達成する。しかし、現在のバージョンでは、このアプローチの実装は、部分的な励起および発光スペクトルの重複を有する6つの蛍光タンパク質(FP)を発現する12の異なるプラスミドの等モル混合物に依存するため、複雑である。
ここで提示される、強力で広く活性なプロモーターによって駆動される統合レポーター構築物を用いた子宮エレクトロポレーションベースの多色ラベリング法における簡単な表題は、皮質アストロサイト14を単一化する。また、ライセンス(例えば、イマリス)とオープンアクセス(Vaa3D18、19、20)の両方を使用した容易な画像解析パイプラインが、それぞれアストロサイトの領土容積と樹状化をセグメント化するために提供される。前述の方法と比較して、この戦略は、細胞質に向けられた1〜2色の多色積分性遺伝子多アドレス組み込み色マーカー(MAGICマーカーまたはMM21)と、細胞メガロウイルスエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、ウサギβ-globinsplicesを含む合成CAGプロモーターによって発現が駆動される核細胞コンパートメントのみに依存する。これにより、胚性から出生後後期までの皮質アストロサイトの標識および追跡が可能となり、GFAP発現14,23とは無関係である。これらのトランス遺伝子のそれぞれは、次の4つの異なるFPを有する:eBFP、mTurquoise2/mCerulean、EYFP、およびtdTomato / mCherryは、1)シーケンシャルチャネル取得で簡単に回避できる最小限のスペクトル重複を表示する;2)最適化された励起力とコレクションのゲイン。3)狭いFP放出窓を収集するために特定の二色フィルタ。MM戦略は、細胞集団におけるFPの確率発現を駆動するために、自己切除可能なCreリコンビナーゼ(seCre)とCre/loxの再結合を使用する。MMトランスジーンの単一のコピーは、相互に排他的な方法でFPを発現し、複数の遺伝子がFPの組み合わせを生み出し、数十の異なる色合いを生み出します。遺伝子導入のゲノム積分は、ピギーバク(PB)またはTol2転置システム24、25、26によって駆動される。したがって、子宮エレクトロポレーションを通して、MMツールキットとそれが生成する多色の「モザイク」は、複数の隣接する皮質前駆物質の同時マーキングと、皮質アストロサイトを含むそれらのグリア降下の追跡を長期間にわたって可能にする。色のコントラストは、PrAの輪郭の明確なFPの表現から生じるコントラストを許可し、その後、その領土容積(IMARISを使用)と複雑な形態(Vaa3Dを使用)に関する重要な情報を抽出します。ここで詳しく示される多色戦略は、様々な発達段階で野生型マウスの皮質アストロサイト表面および形態に迅速かつ容易にアクセスできる便利で堅牢な方法であり、トランスジェニックレポーターラインを使用することなく、神経疾患のマウスモデルにおけるアストロサイト解剖学的特徴を調査するために容易に適応可能である。
Protocol
Representative Results
Discussion
皮質前駆体中のMAGICマーカーの子宮エレクトロポレーション(IUE)では(図1)出生後異なる段階で出生後大脳皮質全体のアストロサイトの標識が可能になった(P4-P7-P21、図2)。興味深いことに、E13.5からE15.5に行われるエレクトロポレーションは皮質アストロサイト14に関する同様の標識パターンをもたらすので、IUEの段階は重要ではない…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.フーケと、モンペリエ研究所とニューロサイエンス・ド・モンペリエ研究所(MRIおよびRAM)のイメージングおよび動物のコア施設に感謝します。この作品は、レギオン・イル=ド・フランスとフォンダシオンARCのフェローシップが、スラ・レシェルシュ・シュル・ル・ガンをS.Cに注ぎ、パリ・サクレー大学(イニシアチブ・ドクナール・ディスクリネール)からL.A.に支援されました。 欧州研究評議会(ERC-SG 336331、PI J.ヴァレット)からE.H.への資金援助により、ANR-10-LABX-65(LabEx LifeSenses)、ANR-11-EQPX-0029(イキペックス・モルホスコープ2)、ANR-10-IN-04、フォンダシオンは、ラ・レシェルシュ・メディカル(Ref. DBI2014123328)、欧州研究評議会(ERC-CoG 649117、PI J.リベット)、およびATIP-Avenirプログラム(PI K.ルーリエ)を注ぎます。
Materials
| 1.1 Bacteria transformation | |||
| Ampicillin | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alpha competent cells | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ice box | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Sterile petri dish- 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Water bath | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Plasmid culture | |||
| 14 ml culture tube | Dutscher | 187262 | |
| Glass erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Plasmid DNA preparation | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparation of the solutions | |||
| 26 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Single-use polypropylene syringe, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparation of the surgery material | |||
| Adson Forceps – DeBakey Pattern- 12.5 cm | FST | 11617-12 | |
| Arched tip Forceps- 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Glass bead sterilizer Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Glass micropipette 1 mm diameter | FHC | 10-10-L | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe Forceps – Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Iris Scissors – Delicate Straight- 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Microinjector | INJECT+MATIC | No catalog number | |
| Olsen-Hegar Needle Holder – 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Optical fiber | VWR | 631-1806 | |
| Plastic-coated white paper | Distrimed | 700103 | |
| Signagel electrode gel | Free-Med | 15-60 | |
| Sterile Petri dish- 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterilizer, glass dry bead, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparation of the pregnant female mouse | |||
| Alcohol pad | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg/ml | |
| Compress | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamine | Merial | Imalgene 1000 | |
| Ocular gel | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS mice | Janvier Labs | ||
| Vetadine, 10% solution | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Warming pad | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Electroporation | |||
| Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse | Novosyn | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Sterile transfer pipets (individually wrapped) | Dutscher | 043202S | |
| Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Tissue harvesting and sectioning | |||
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Coverslip | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Nail polish | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Multichannel confocal imaging | |||
| 20X oil NA 0.85 | Olympus | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Astrocyte territorial volume segmentation | |||
| IMARIS 8.3 and later versions | Bitplane | ||
| 7. Astrocyte arborization tracing | |||
| 3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D) | HHMI – Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science |
References
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