Det presenterade protokollet kan bestämma vektorkompetensen hos Aedes aegypti myggpopulationer för ett visst virus, såsom Zika, i en inneslutningsmiljö.
De förfaranden som presenteras beskriver en generaliserad metod för att infektera Aedes aegypti myggor med Zika virus under laboratorieförhållanden för att bestämma graden av infektion, spridad infektion och potentiell överföring av viruset i myggpopulationen i fråga. Dessa procedurer används i stor utsträckning med olika modifieringar i vektorkompetensutvärderingar globalt. De är viktiga för att bestämma den potentiella roll som en viss mygga (dvs. art, population, individ) kan spela vid överföring av ett visst medel.
Vektorkompetens definieras som förmågan på art-, populations- och till och med en individs nivå hos en viss leddjur som mygga, fästing eller phlebotomine sandfluga, att förvärva och överföra ett medel biologiskt med replikering eller utveckling i leddjuret1,2. När det gäller myggor och leddjurburna virus (dvs. arbovirus) är medlet insuperat från en viremic värd av en kvinnlig mygga. Efter intag måste viruset produktivt infektera en av en liten population av midgut epitelceller3, övervinna olika fysiologiska hinder som proteolytisk nedbrytning av matsmältningsenzymer, närvaron av mikrobiota (midgut infektionsbarriären eller MIB) och den utsöndrade peritrofiska matrisen. Infektion av midgut epitel måste följas av replikering av viruset och eventuell flykt från midguten till myggans öppna cirkulationssystem, eller hemolymph, som representerar uppkomsten av en spridad infektion övervinna midgut escape barrier (MEB). Vid denna tidpunkt kan viruset fastställa infektioner i sekundära vävnader (t.ex. nerver, muskler och fettkroppar) och fortsätta att replikera, även om sådan sekundär replikering kanske inte är absolut nödvändig för att viruset ska infektera salivkörtlarnas acinära celler (övervinna salivkörtelinfektionsbarriären). Utgående från salivkörtelacincellerna i deras apikala håligheter och sedan rörelse i salivkanalen möjliggör inokulering av viruset till efterföljande värdar vid bitning och slutför överföringscykeln1,2,4,5,6,7.
Med tanke på denna väl karakteriserade och allmänt bevarade spridningsmekanism inom en myggvektor är laboratorievektorkompetensbedömningar ofta metodologiskt lika, även om skillnader i protokoll finns1,2. I allmänhet, efter oral virusexponering, dissekeras myggor så att enskilda vävnader som midgut, ben, äggstockar eller salivkörtlar kan analyseras för virusinfektion, spridad infektion, spridad infektion / potentiell transovariell överföring och spridad infektion / potentiell överföringskompetens, respektive8. Blotta förekomsten av ett virus i salivkörtlarna är dock inte definitiva bevis på överföringsförmåga, givet bevis på en salivary gland escape /egress barrier (SGEB) i vissa vektor/ viruskombinationer1,2,4,5,7,9. Standardmetoden för att bevisa överföringskompetens förblir myggöverföring till ett mottagligt djur10,11,12. Men med tanke på att för många arbovirus kräver detta användning av immunkomprometterade murinmodeller13,14,15,16, är denna metod ofta kostnadsöverkomlig. Ett vanligt alternativ är insamlingen av myggsaliv, som kan analyseras genom omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) eller en infektiös analys för att visa närvaron av virusgenomet respektive infektiösa partiklar. Det är värt att notera att sådana in vitro-metoder för insamling av saliv kan överskatta12 eller underskatta17 mängden virus som deponeras under in vivo-utfodring, vilket indikerar att sådana uppgifter måste tolkas med försiktighet. In vitro-metoden är dock mycket värdefull när den analyseras ur perspektivet av blotta närvaron av virus i saliven, vilket indikerar överföringspotential.
Två viktiga metoder finns för att bestämma myggvektorernas roll vid utbrott av arboviralsjukdomar. Den första metoden innebär fältövervakning, där myggor samlas in i samband med aktiv överföring18,19,20,21,22,23,24. Med tanke på att infektionsfrekvensen vanligtvis är ganska låg (t.ex. den uppskattade 0,061% infektionshastigheten för myggor i områden med aktiv Zika-virus (ZIKV) cirkulation i USA21), kan inskrivning av potentiella vektorarter vara kraftigt partisk genom fångstmetod25,26 och slumpmässig slump (t.ex. provtagning av en infekterad individ av 1 600 oinfekterade)21 . Med hänsyn till detta får en viss studie inte förvärva tillräckligt med myggor i både råantal eller artmångfald för att noggrant prova myggor som är involverade i överföring. Däremot görs vektorkompetensanalyser i laboratoriemiljö, vilket möjliggör strikt kontroll av parametrar som oral dos. Även om de inte är fullt kapabla att representera den verkliga komplexiteten hos mygginfektion och överföringskapacitet i en fältmiljö, förblir dessa laboratoriebedömningar kraftfulla verktyg inom arbovirologi.
Baserat på olika vektorkompetensanalyser med ZIKV i flera myggarter, populationer och metoder27,28,29,30,31,32, samt en nyligen genomgång av vektorkompetensbedömningar1, beskriver vi här flera av protokollen i samband med ett typiskt vektorkompetensarbetsflöde. I dessa experiment utsattes tre Ae. aegypti populationer från Amerika (staden Salvador, Brasilien; Dominikanska republiken; och den nedre Rio Grande Valley, TX, USA) för en enda stam av ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) vid 4, 5 eller 6 log10 fokusbildande enheter (FFU) / ml doser genom konstgjorda blodmjöl. Därefter analyserades de för bevis på infektion, spridas infektion och överföring kompetens efter olika tider av extrinsic inkubation (2, 4, 7, 10 och 14 dagar) med hjälp av dissekering och en cell kultur-baserade infektiös analys. Även om det nuvarande arbetsflödet/protokollen är optimerade för ZIKV, kan många element direkt översättas till andra myggburna arbovirus i leddjursinneslutning och biosäkerhetsnivåer 2 och 3 (ACL/BSL2 eller ACL/BSL3).
Metoderna som beskrivs här ger ett generaliserat arbetsflöde för att genomföra vektorkompetensanalyser. Som en allmän ram bevaras många av dessa metoder i hela litteraturen. Det finns dock stort utrymme för ändringar (granskas i Azar och Weaver1). Virus (t.ex. virus härstamning, lagring av utmaningsvirus, viral passagehistoria), entomologi (t.ex. laboratoriekolonisering av myggpopulationer, medfödd immunitet, myggmikrobiom/virom) och experimentella variabler (t.ex. blodmjölssammansättn…
The authors have nothing to disclose.
Vi bekräftar personalen vid World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton och Divya Mirchandani, för deras outtröttliga arbete med att kurera och tillhandahålla många av de virusstammar som används för våra och andra gruppers vektorkompetensexperiment. Det presenterade arbetet finansierades av McLaughlin Fellowship Fund (SRA) och NIH-bidrag ai120942 och AI121452.
3mL Standard Reservoir | R37P30 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls | 4RJH9 | Grainger | Grinding Media |
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case | A16-P4 | FisherScientific | Fixative |
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture | A6419-1G | MilliporeSigma | Reagent |
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 | MAB10216 | MilliporeSigma | Primary Antibody for focus forming assay |
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle | 5450-0011 | KPL/Seracare | Secondary Antibody for focus forming assay |
Bleach | NC0427256 | FisherScientific | Decontamination |
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 | 10-126-34 | FisherScientific | Cell culture consumable |
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning | 07-200-740 | FisherScientific | Cell culture consumable |
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning | 07-200-91 | FisherScientific | Cell culture consumable |
Crystal Violet | C0775-100G | MilliporeSigma | Stain |
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case | 05-402-7 | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes | 14-959-70C | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes | 14-959-49A | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case | 13-675-20 | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case | 13-675-15B | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case | 13-675-30 | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case | 13-675-22 | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon Standard Tissue Culture Dishes | 08-772B | FisherScientific | Plastic consumable |
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL | S11150 | Atlanta Biologicals | Cell culture reagent |
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | 12-550-A3 | FisherScientific | Immobilization of Mosquitos |
FU1 Feeder | FU1-0 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment; feeding units |
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles | 140-040-182 | FisherScientific | Cell culture reagent |
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle | 15-290-026 | Fisher Scientific | Cell culture reagent |
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case | 15-140-163 | FisherScientific | Cell culture reagent |
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles | 25-200-114 | FisherScientific | Cell culture reagent |
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles | 11-965-118 | FisherScientific | Cell culture reagent |
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit | 7203706 | Lampire | Bloodmeal preparation |
InsectaVac Aspirator | 2809B | Bioquip | Insectary Equipment |
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case | A412-4 | FisherScientific | Fixative |
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle | M0512-250G | MilliporeSigma | Cell culture reagent |
Micro-chem Plus Disinfectant Detergent | C849T34 | Thomas Scientific | Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium |
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology | M5904-5X5ML | MilliporeSigma | Immobilization of Mosquitos |
O-rings | OR37-25 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
Plastic Plugs | PP5-250 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
PS6 Power Unit (110-120V) | PS6120 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment; power source |
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points | 4525 | Bioquip | Insectary Equipment |
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case | 50-809-242 | FisherScientific | Plastic consumable |
Sucrose, BioUltra, for molecular biology | 84097-250G | MilliporeSigma | Reagent |
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case | 21-402-487 | FisherScientific | Plastic consumable |
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-486 | FisherScientific | Plastic consumable |
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-484 | FisherScientific | Plastic consumable |
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-482 | FisherScientific | Plastic consumable |
TissueLyser II | 85300 | QIAGEN | Homogenization |
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL | 5510-0030 | Seracare | Developing solution for focus forming assay |
Vero | CCL-81 | American Type Culture Collection | Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay |
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] | CRL-1586 | American Type Culture Collection | Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay |