Entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de ratos e ratos: aplicação à isquemia cerebral
Summary
Um método para fornecer células-tronco neurais, adaptáveis para soluções ou suspensões injetáveis, através da artéria carótida comum (mouse) ou artéria carótida externa (rato) após o derrame isquêmico ser relatado. As células injetadas são distribuídas amplamente por todo o parenchyma cerebral e podem ser detectadas até 30 d após o parto.
Abstract
A terapia com células-tronco neurais (NSC) é um tratamento inovador emergente para derrame, lesão cerebral traumática e distúrbios neurodegenerativos. Em comparação com a entrega intracraniana, a administração intra-arterial de NSCs é menos invasiva e produz uma distribuição mais difusa de NSCs dentro do parênquim cerebral. Além disso, a entrega intra-arterial permite o efeito de primeira passagem na circulação cerebral, diminuindo o potencial de captura de células em órgãos periféricos, como fígado e baço, uma complicação associada a injeções periféricas. Aqui, detalhamos a metodologia, tanto em camundongos quanto em ratos, para a entrega de NSCs através da artéria carótida comum (rato) ou artéria carótida externa (rato) para o hemisfério ipsilateral após um derrame isquêmico. Usando NSCs rotulados por GFP, ilustramos a distribuição generalizada alcançada em todo o hemisfério ipsilateral de roedores em 1 d, 1 semana e 4 semanas após a entrega pós-isquêmica, com maior densidade dentro ou perto do local de lesão isquêmica. Além da sobrevivência a longo prazo, mostramos evidências de diferenciação de células rotuladas por GFP em 4 semanas. A abordagem de entrega intra-arterial descrita aqui para NSCs também pode ser usada para administração de compostos terapêuticos, e, portanto, tem ampla aplicabilidade a variados modelos de lesões e doenças de CNS em várias espécies.
Introduction
A terapia com células-tronco (SC) tem um enorme potencial como tratamento para doenças neurológicas, incluindo acidente vascular cerebral, traumatismo craniano e demência1,,2,3,4,,5,6. No entanto, um método eficiente para fornecer SCs exógenos ao cérebro doente permanece problemático2,6,7,8,9,10,11,12,13. As SCs entregues através de rotas de entrega periféricas, incluindo injeção intravenosa (IV) ou intraperitoneal (IP), estão sujeitas à filtragem de primeira passagem na microcirculação, especialmente no pulmão, fígado, baço e músculo8,,9,,13,,14, aumentando as chances de acúmulo de células em áreas não-alvo. O método de injeção intracerebral invasivo resulta em danos localizados no tecido cerebral e uma distribuição muito restrita de SCs perto do local da injeção2,6,,8,,14,15,,16. Recentemente estabelecemos um método de injeção intra-arterial à base de cateter para fornecer SCs neurais exógenos (NSCs), que é descrito aqui aplicado em um modelo de roedor de derrame isquêmico focal. Induzimos lesão transitória (1 h) isquemia-reperfusão em um hemisfério usando um filamento revestido de borracha de silicone para ocluir a artéria cerebral média esquerda (MCA) no camundongo ou rato17,,18,,19. Neste modelo, observamos de forma reprodutiva aproximadamente 75-85% a depressão do fluxo sanguíneo cerebral (CBF) no hemisfério ipsilateral com Laser Doppler ou Laser speckle imaging17,19, gerando déficits neurológicos consistentes17,,18,,19.
Para fins de economia de tempo, o vídeo é definido para jogar em duas vezes a velocidade normal e procedimentos cirúrgicos de rotina, como preparação da pele e fechamento de feridas com sutura e o uso e configuração da bomba de seringa motorizada não são apresentados. O método de entrega intra-arterial de NSCs é demonstrado no contexto do modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) de derrame experimental em roedores. Por isso, incluímos o procedimento de derrame isquêmico transitório, a fim de demonstrar posteriormente como a segunda cirurgia, a injeção intra-arterial, é realizada utilizando o local cirúrgico anterior no mesmo animal. A viabilidade da entrega intra-arterial de NSC em modelos de curso de roedores é demonstrada pela avaliação da distribuição e sobrevivência de NSCs exógenos. A eficácia da terapia NSC para atenuar a patologia cerebral e disfunção neurológica será relatada separadamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
A terapia com células-tronco para doenças neurológicas ainda está em estágio exploratório precoce. Uma questão importante é que não há um método estabelecido para a entrega suficiente de SCs ou NSCs no cérebro.
Embora SCs/NSCs exógenos possam ser detectados no cérebro após injeção intravenosa (IV), intraperitoneal (IP) ou intraparenquimal/intracerebral, cada abordagem de entrega tem desvantagens. Estima-se que a população detectável dentro do cérebro seja muito baixa com i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo seguinte: Prêmio AHA 14SDG20480186 para LC, equipe de inovação de assuntos da Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 para BZ, e Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust bolsa 14-12A para KES e LC.
Materials
| 20 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305175 | preparation of injection catheter |
| 26 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305111 | preparation of injection catheter |
| 27 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305136 | preparation of injection catheter |
| 4-0 NFS-2 suture with needle | Henry Schein Animal Health | 56905 | surgery |
| 6-0 nylon suture | Teleflex/Braintree Scientific | 104-s | surgery |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7922 | cell detachment solution |
| blade | Bard-Parker | 10 | surgery |
| Buprenorphine-SR Lab | ZooPharm | Buprenorphine-SR Lab® | analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d) |
| Calcium/magnisum free PBS | VWR | 02-0119-0500 | NSC dissociation |
| DCX antibody | Millipore | AB2253 | immunostaining |
| GFAP antibody | Invitrogen | 180063 | immunostaining |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 50562-1 | surgery |
| MCAO filament for mouse | Doccol | 702223PK5Re | surgery |
| MCAO filament for rat | Doccol | 503334PK5Re | surgery |
| MRE010 catheter | Braintree Scientific | MRE010 | preparation of injection catheter |
| MRE025 catheter | Braintree Scientific | MRE025 | preparation of injection catheter |
| MRE050 catheter | Braintree Scientific | MRE050 | preparation of injection catheter |
| Nu-Tears Ointment | NuLife Pharmaceuticals | Nu-Tears Ointment | eye care during surgery |
| S&T Forceps – SuperGrip Tips JF-5TC Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | surgery |
| S&T Forceps – SuperGrip Tips JF-5TC Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | surgery |
| Superglue | Pacer Technology | 15187 | preparation of injection catheter |
| syringe pump | Kent Scientific | GenieTouch | surgery |
| Tuj1 antibody | Millipore | MAb1637 | immunostaining |
| two-component 5 minute epoxy | Devcon | 20445 | preparation of injection catheter |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | surgery |
| vascular clamps | Fine Science Tools | 00400-03 | surgery |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axio Imager 2 | microscopy |
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