Évaluation du stress oxydatif dans des échantillons biologiques à l’aide du test des substances réactives de l’acide thiobarbiturique

Summary

L’objectif du test des substances réactives à l’acide thiobarbiturique est d’évaluer le stress oxydatif dans des échantillons biologiques en mesurant la production de produits de peroxydation lipidique, principalement du malondialdéhyde, en utilisant la spectrophotométrie de longueur d’onde visible à 532 nm. La méthode décrite ici peut être appliquée au sérum humain, aux lysats cellulaires et aux lipoprotéines de basse densité.

Abstract

Malgré sa spécificité analytique et sa robustesse limitées, le dosage des substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS) a été largement utilisé comme mesure générique de la peroxydation lipidique dans les fluides biologiques. Il est souvent considéré comme un bon indicateur des niveaux de stress oxydatif dans un échantillon biologique, à condition que l’échantillon ait été correctement manipulé et stocké. Le test implique la réaction de produits de peroxydation lipidique, principalement le malondialdéhyde (MDA), avec l’acide thiobarbiturique (TBA), ce qui conduit à la formation d’adduits MDA-TBA2 appelés TBARS. TBARS donne une couleur rouge-rose qui peut être mesurée spectrophotométriquement à 532 nm. Le test TBARS est effectué dans des conditions acides (pH = 4) et à 95 °C. Le MDA pur est instable, mais ces conditions permettent la libération de MDA à partir du MDA bis(diméthylacétal), qui est utilisé comme norme analytique dans cette méthode. Le test TBARS est une méthode simple qui peut être complétée en environ 2 h. La préparation des réactifs d’essai est décrite en détail ici. Les chercheurs soucieux de leur budget peuvent utiliser ces réactifs pour plusieurs expériences à faible coût plutôt que d’acheter un kit de test TBARS coûteux qui ne permet la construction que d’une seule courbe standard (et ne peut donc être utilisé que pour une seule expérience). L’applicabilité de ce test TBARS est démontrée dans le sérum humain, les lipoprotéines de basse densité et les lysats cellulaires. Le test est cohérent et reproductible, et des limites de détection de 1,1 μM peuvent être atteintes. Des recommandations pour l’utilisation et l’interprétation du test spectrophotométrique TBARS sont fournies.

Introduction

La peroxydation lipidique est un processus dans lequel les radicaux libres, tels que les espèces réactives de l’oxygène et les espèces réactives de l’azote, attaquent les doubles liaisons carbone-carbone dans les lipides, un processus qui implique l’extraction d’un hydrogène à partir d’un carbone et l’insertion d’une molécule d’oxygène. Ce processus conduit à un mélange de produits complexes, y compris les radicaux peroxyles lipidiques et les hydroperoxydes comme produits primaires, ainsi que le malondialdéhyde (MDA) et le 4-hydroxynonénal comme produits secondaires ^{prédominants1}.

Le MDA a été largement utilisé dans la recherche biomédicale comme marqueur de la peroxydation lipidique en raison de sa réaction facile avec l’acide thiobarbiturique (TBA). La réaction conduit à la formation de MDA-TBA2, un conjugué qui absorbe dans le spectre visible à 532 nm et produit une couleur rouge-rose2. D’autres molécules dérivées de la peroxydation lipidique en plus du MDA peuvent également réagir avec le TBA et absorber la lumière à 532 nm, contribuant ainsi au signal d’absorption global mesuré. De même, la MDA peut réagir avec la plupart des autres grandes classes de biomolécules, ce qui pourrait limiter son accessibilité à la réaction avec ^TBA3,4. En tant que tel, ce test traditionnel est simplement considéré comme mesurant les « substances réactives de l’acide thiobarbiturique » ou ^TBARS5.

Lorsqu’il est correctement appliqué et interprété, le test TBARS est généralement considéré comme un bon indicateur des niveaux globaux de stress oxydatif dans un échantillon ^biologique6. Malheureusement, comme l’ont documenté Khoubnasabjafari et d’autres, le test TBARS est souvent mené et interprété de manière à faciliter les conclusions douteuses3,4,7,8,9,10,11. Les causes en sont principalement enracinées dans les variables pré-analytiques liées à l’échantillon et un manque de robustesse du test qui interdit des variations apparemment mineures dans le protocole d’essai sans changements substantiels dans les résultats du test1,7,12,13.

Les variables préanalytiques liées à la manipulation et au stockage des échantillons biologiques (p. ex., plasma sanguin conservé temporairement à -20 °C)^14,15 peuvent avoir un impact majeur sur les résultats des essais TBARS16,17; à tel point que les résultats des tests TBARS ne devraient pas être comparés entre différents laboratoires à moins que des données explicites de validation analytique interlaboratoire ne le justifient. Cette recommandation s’apparente à la façon dont les transferts de Western sont couramment utilisés et interprétés. Les comparaisons des densités de bande sont valables pour les études à l’intérieur du transfert et peut-être à l’intérieur du laboratoire, mais la comparaison des densités de bande entre laboratoires est généralement considérée comme une pratique invalide.

Certains chercheurs ont suggéré que la MDA telle que mesurée par le test TBARS ne répond tout simplement pas aux critères analytiques ou cliniques requis pour un biomarqueur acceptable3,9,10,18,19. En effet, si le test n’avait pas été développé il y a plus de 50 ans, il n’aurait probablement pas acquis l’utilisation généralisée et l’acceptabilité tacite qu’il a aujourd’hui. Bien qu’il existe d’autres tests avec une sensibilité analytique, une spécificité et une robustesse plus élevées utilisés pour déterminer le stress oxydatif, le test TBARS basé sur l’absorbance à 532 nm reste de loin l’un des tests les plus couramment utilisés pour la détermination de la peroxydation ^lipidique20, et donc l’évaluation du stress oxydatif.

Le test TBARS ne peut être trouvé que sous la forme d’un kit coûteux (plus de 400 dollars américains), dans lequel les instructions ne fournissent pas d’informations détaillées sur la plupart des concentrations des réactifs utilisés. De plus, les réactifs fournis ne peuvent être utilisés que pour une seule expérience, car une seule courbe standard colorimétrique peut être réalisée par kit. Cela peut être problématique pour les chercheurs qui ont l’intention de déterminer les niveaux d’oxydation dans quelques échantillons à différents moments, car la même courbe standard ne peut pas être utilisée à plusieurs reprises. Par conséquent, plusieurs kits doivent être achetés pour plusieurs expériences. Actuellement, à moins qu’un kit coûteux ne soit acheté, il n’existe pas de protocole détaillé sur la façon d’effectuer un test TBARS. Certains chercheurs dans le passé ont vaguement décrit comment effectuer un test ^TBARS21,22, mais ni un protocole entièrement détaillé ni une vidéo complète sur la façon de mener le test TBARS sans un kit coûteux n’est disponible dans la littérature.

Nous rapportons ici une méthodologie détaillée, validée analytiquement et à cet effet sur la façon d’effectuer un test TBARS de manière simple, reproductible et peu coûteuse. Les changements dans la peroxydation lipidique du sérum humain, des lysats d’HepG2 et des lipoprotéines de basse densité lors du traitement par des ions Cu(II) sont démontrés à titre d’applications illustratives pour le test TBARS. Les résultats démontrent que ce test TBARS est cohérent et reproductible au quotidien.

Protocol

Des échantillons de sérum humain ont été obtenus auprès de volontaires consentants sous l’approbation de la CISR et conformément aux principes exprimés dans la Déclaration d’Helsinki. Les échantillons ont été codés et anonymisés avant d’être transférés au laboratoire d’analyse. 1. Préparation de l’échantillon Lysats de cellules HepG2 Ensemencez environ 10 x 106 cellules HepG2 par fiole dans 16 fioles T75 avec 14 mL de …

Representative Results

Dans des conditions acides (pH = 4) et à 95 °C, le malondialdéhyde (MDA) bis(diméthylacétal) donne du MDA23. Le MDA et les congénères chimiques étroitement apparentés réagissent avec deux molécules d’acide thiobarbiturique (TBA) pour produire des composés appelés substances réactives de l’acide thiobarbiturique (TBARS), qui donnent une couleur rouge-rose et ont une absorbance λmax à 532 nm (Figure 1, Figure 2</strong…

Discussion

Malgré ses limites1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 et un manque d’aptitude à la comparaison entre laboratoires, le test TBARS est l’un des plus ^…

Materials

1x Sterile PBS pH 7.4 1 L	VWR, PA	101642–262	cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tube	Corning, NY	CLS430897	General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile	Thermo Fisher Scientific, MA	280895	To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device	Fisher Scientific, NH	UFC510024	LDL purification
Caps for glass tubes	Thermo Fisher Scientific, MA	14-930-15D	for TBARS assay
Copper II Chloride	SIGMA, MO	222011-250G	to induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm)	VWR, PA	53283-800	for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)	ATCC, VA	HB-8065	HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	eppendorf, NY	22363204	General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL	Genesee Sceitific, CA	22363352	General material
Fetal Bovine Serum US Source	Omega Scientific, CA	FB-11	for cell culture
Glacial Acetic Acid	SIGMA, MO	27225-1L-R	TBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)	Thermo Scientific, MA	87786	cell lysis reagent
HEPES	SIGMA, MO	H3375-250G	LDL solvent
HepG2 Cells	ATCC, VA	HB-8065	Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl)	Fisher Scientific, NH	A144-212	cell lysis reagent
Legend Micro 17 Centrifuge	Thermo Scientific, MA	75002431	General material
Low Density Lipoprotein, Human Plasma	Athens Research & Technology, GA	12-16-120412	Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment	VWR, PA	58948-025	General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal)	SIGMA, MO	8207560250	TBARS Standard
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer	Fisher Scientific, NH	51119200	To measure absorbance
NP-40	EMD Millipore Corp, MA	492016-100ML	cell lysis reagent
Sodium Chloride	SIGMA, MO	S7653-1KG	cell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	SIGMA, MO	436143-100G	TBARS Reagent
Sodium hydroxide	SIGMA, MO	367176-2.5KG	TBARS Reagent
SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific, MA	SC250EXP	For concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap	USA Scientific, FL	658175	cell culture
Thiobarbituric Acid	SIGMA, MO	T5500-100G	TBARS Reagent
TRIS base	Fluka, GA	93362	cell lysis reagent
Trypsin (1x)	VWR, PA	16777-166	To detach HepG2 cells