Den Flypub assay måler den adfærd, at frugtfluen Drosophila melanogaster viser under indflydelse af ethanol. Analysen kan let beherskes af eksperimentatorer på alle niveauer og anvendes til forskellige fordampede stimuli, lette stofmisbrug og afhængighed undersøgelser.
Alkoholbrug lidelse (AUD) er fortsat et alvorligt problem i vores samfund. For at udvikle effektive interventioner for afhængighed er det vigtigt at forstå de underliggende neurobiologiske mekanismer, for hvilke der er behov for forskellige eksperimentelle tilgange og modelsystemer. Den vigtigste ingrediens i alkoholholdige drikkevarer er ethanol, som forårsager adaptive ændringer i centralnervesystemet og adfærd ved kronisk indtag. Adfærdsmæssige sensibilisering (dvs. eskalerede svar) især repræsenterer en vigtig adaptive ændring underliggende afhængighed. De fleste ethanol-induceret adfærdsmæssige sensibilisering undersøgelser i dyremodeller er blevet udført på den bevægende aktiverende effekt af ethanol. En fremtrædende effekt af ethanol er adfærdsmæssig disinhibition. Adfærdsmæssige sensibilisering til disinhibition effekt af ethanol, dog, er underrepræsenteret. For at løse dette problem, vi udviklet Flypub assay, der gør det muligt at måle den eskalerede stigning i disinhibited frieri aktiviteter ved tilbagevendende ethanol eksponering i Drosophila melanogaster. Her rapporterer vi den trinvise Flypub-analyse, herunder samling af ethanoleksponeringskamre, opsætning af analysestationen, kriterier for fluepleje og -indsamling, ethanollevering, kvantificering af disinhibited frieri, databehandling og statistisk analyse. Der er også mulighed for fejlfinding af kritiske trin, overvinde begrænsninger og udvide dens nytte til at vurdere yderligere ethanol-induceret adfærd. Den Flypub assay i kombination med kraftfulde genetiske værktøjer i Drosophila melanogaster vil lette opgaven med at opdage den mekanisme, der ligger til grund for ethanol-induceret adfærdsmæssige sensibilisering.
Alkohol er en af de lettest tilgængelige og almindeligt forbruges narkotika i verden. Det har et stort potentiale for misbrug og afhængighed; Den mekanisme, der ligger til grund for denne proces, er imidlertid stadig ufuldstændigt forstået. Ethanol inducerer disinhibition, eufori, kognitiv svækkelse, hyperaktivitet, tab af motorisk kontrol og sedation i orme1, bananfluer1,,2,,3, mus4, rotter5 og mennesker6, hvilket indikerer fælles neurobiologiske komponenter, der mægleethanol virkninger fra hvirvelløse dyr til pattedyr, herunder mennesker. Kronisk ethanol indtag forårsager neurale tilpasninger og adfærdsmæssige ændringer, der ligger til grund for AUD. En af tilpasningerne er adfærdsmæssig sensibilisering defineret som augmented response med gentagne erfaringer med ethanol7,8,9 eller andre vanedannende stoffer10,11,12.
I løbet af årtierne har undersøgelserne af ethanol-induceret adfærdssensibilisering (EIBS) fokuseret på den bevægelsesstimulerende virkning, der anvendes som indikator for et euforisk respons7,8,9,13. For eksempel viser rotter eller mus ved gentagen (hver 24, 48 eller 72 h) ethanoladministration den forstærkede bevægelsesaktivitet målt ved ganghastighed8,14,15,16,17,18,19,20,21. På samme måde udviser bananfluerne, der udsættes for den anden eksponering for ethanoldamp 4 timer efter den første eksponering, den forbedrede bevægelsesrespons målt ved ganghastighed samt22. Selv om der ikke foreligger oplysninger om den mekanisme, der ligger til grund for EIBS, til den bevægelsesstimulerende virkning i bananfluer, har undersøgelserne hos rotter og mus afdækket de molekylære og signalerende komponenter (f.eks. dopamin-, glutamat- og GABA-systemerne) samt neurale substrater og kredsløb (f.eks. det ventrale tegmentale område, kerneaccumbener, amygdala og præfrontal cortex), der spiller store roller for EIBS6,9,23.
Disinhibition er en stor effekt af ethanol og fører til manifestation af adfærd, der typisk er begrænset. Den disinhibiting effekt udøves på motoriske, følelsesmæssige, sociale, seksuelle og kognitive funktioner, hvilket kan føre til upassende seksuel adfærd, verbal eller fysisk aggression og impulsive handlinger hos mennesker og dyremodeller24,25,26,27,28,29. Ethanol-induceret disinhibition er blevet undersøgt i dyremodeller for mekanistiske undersøgelser , og de omfatter motorisk impulsivitet og aggression hos gnavere og aber samt fouragering disinhibition i orme6,9,24,28,29,30. Vi har vist, at bananfluer viser disinhibited seksuel adfærd under indflydelse af ethanol31. Specifikt, vilde mænd flyver sjældent ret andre mænd uden ethanol31 og når de gør, kurtisaner aktivt afvise bejle nikker. Under indflydelse af ethanol, dog, mandlige fluer viser mere frieri mod andre mænd og kurtisane udviser mindre afvisning, hvilket resulterer i samlede øget intermale frieri. Især, fluer udvikle adfærdsmæssige sensibilisering til disinhibition effekt ved tilbagevendende ethanol eksponering, der tjener som et unikt system til at studere EIBS31,32.
I denne rapport beskriver vi, hvordan du opsætter, udfører, troubleshooter og analyserer Flypub-analysen og data for at studere ethanol-induceret disinhibition og sensibilisering i frugtfluen Drosophila melanogaster. For at give sin nytte og effektivitet, vi testede wild-type Canton-S (CS; kontrol flyve stamme) sammen med fluer mangelfuld i tyramin β hydroxylase (tβh), der syntetiserer octopamin (OA). OA er en stor neuromodulator i hvirvelløse dyr33,34 og spiller en central rolle i udviklingen af ethanol tolerance i fluer22. Vi rapporterer her for første gang, at OA er vigtig for EIBS.
I denne rapport har vi beskrevet opsætningen og den detaljerede protokol for Flypub-analysen; en ny metode til at måle, hvordan tilbagevendende ethanol eksponering udløser disinhibited frieri og adfærdsmæssige sensibilisering. Selv om Flypub assay er relativt ligetil, flere trin kræver omhu og opmærksomhed for at sikre pålidelige resultater. For det første skal fluerne til test være fuldt pigmenterede (dvs. fuldt udviklede voksne fluer), sunde og intakte. Deformiteter eller skader især i deres vinger eller ben kan påvirke den mandlige evne til at retten. For det andet er flyvealderen vigtig og skal matches mellem kontrol- og forsøgsgrupper (optimal alder: 3-5 dage gammel ved ethanoleksponering 1). To uger og ældre vilde-type mandlige fluer tendens til at vise de forhøjede niveauer af disinhibited frieri31. Således, ordentlig aldersmatchning af fluer under undersøgelse er afgørende for at undgå variable resultater. For det tredje er fluenummeret pr. pub afgørende (optimalt: 33 pr. pub). De lavere eller højere flyve tal pr pub kan i høj grad skæve frieri score (data ikke vist). For det fjerde skal Flypub-kamrene have samme volumen som vist i figur 2B. Dette sikrer, at fluer modtager ethanol damp synkront og fremkaldte adfærd er konsekvent. For det femte er klar videooptagelse og præcis frieri scoring afgørende. Denne protokol afhænger i høj grad af adfærdsmæssige observationer, så omhyggelig overholdelse af den standardiserede frieri scoring protokol er afgørende for at minimere inkonsekvente resultater. Endelig anbefales det stærkt, at både ethanoleksponering og frieriets scoringstrin udføres blindt, hvor en eksperimentator ikke er klar over fluegenotyper eller eksperimentelle behandlinger, hvorved eksperimentelle bias forhindres.
Den Flypub assay har flere fordele. For det første kan flere grupper af fluer testes og sammenlignes samtidigt. For det andet er det billigt, nemt at setup og let at lære, hvilket gør det meget modtagelige for eksperimentatorer på alle niveauer, herunder elementære gennem high school, bachelor-og kandidatstuderende, postdocs og fakultetsamt undervisning laboratorier med begrænset plads og budgetter. For det tredje kan det bruges til at måle yderligere adfærd såsom disinhibited frieri af kvindelige fluer og den beroligende virkning af ethanol eller andre beroligende midler til at vurdere indledende følsomhed og tolerance udvikling og vedligeholdelse31,32. Sammen er Flypub en alsidig metode til at studere forskellige funktioner i AUD.
Den største begrænsning af Flypub assay er den strenge og besværlige frieri scoring regime. Frieri adfærd under indflydelse af ethanol er meget dynamisk på en måde, at frieri varighed spænder fra mindre end et sekund til mange minutter, og fluer engageret i frieri er temmelig ofte skiftende. Den her præsenterede scoringsordning blev udviklet for at indarbejde denne dynamiske karakter og give ensartede scorer på individuelle ethanoleksponeringer for en given genotype31,32. Som nævnt i protokollen, er frieri aktivitet manuelt scoret, hvilket er tidskrævende. Der er udviklet flere automatiserede scoringsprogrammer for at lette en objektiv adfærdsscreening med høj gennemløb , og som alle er afhængige af individuelle fluers bevægelser og placeringer39,40,41,42,43,44,45. Vi forsøgte også at udvikle en computersoftware til automatisk at tælle frieri aktivitet, men var ude af stand til at opnå konsekvente og pålidelige resultater. Dette kan skyldes det faktum, at adfærdsmæssige scoring omfatter flere frieri skridt (dvs. efter, ensidig fløj forlængelse, abdominal bøjning og montering)35,36,46 af flere fluer på én gang. Selv med denne begrænsning, en eksperimentator med tilstrækkelig uddannelse bør være i stand til at kvantificere ethanol-induceret frieri adfærd med konsistens og nøjagtighed. Ikke desto mindre ville det være en stor hjælp og betydning at vedtage machine learning eller andre avancerede algoritmer som opfølgning.
I lighed med gnavere modeller, har undersøgelserne af ethanol i fluemodellen i vid udstrækning fokuseret på ethanolens bevægelsesstimulerende og beroligende virkninger. Den Flypub assay dog foranstaltninger disinhibited frieri, en form for kognitiv disinhibition, som er roman31,32. Derfor kan Flypub støtte til at belyse de molekylære spillere, cellulære veje og neurale kredsløb samt risikofaktorer (f.eks alder, søvn, kost eller socialt miljø) kritisk for adfærdsmæssige disinhibition og sensibilisering. Vi har tidligere påvist, at der kræves dopaminsignalering for EIBS, hvilket er i overensstemmelse med resultaterne i gnavere modeller og mennesker6,9,31. Også som et proof of concept undersøgte vi tβ h-mutanten, der manglede OA (invertebatmoden af noradrenalin) og fandt ud af, at OA også er vigtig for adfærdsmæssig esibilisering af ethanolens disinhibitioneffekt, selv om dens bidrag er relativt lille i forhold til dopamin31.h Dette resultat står i modsætning til Scholz47’s observation af, at de mutantfluer, der er tβh, ikke udviser tydelige svækkelser ved sensibiliseringen af ethanolens bevægelseseffekt47. Dette tyder på særskilte molekylære, cellulære og neurale veje mægle adfærdsmæssige sensibilisering til disinhibition versus bevægelsesmidler. Opfølgende undersøgelser bør yderligere samarbejde denne fristende begreb.
Sammenfattende er Flypub en billig, mangesidet og effektiv metode til at undersøge adfærdsmæssige reaktioner på ethanol, især disinhibition og adfærdsmæssige sensibilisering, der kan bidrage til at fremme vores forståelse af AUD og give indsigt i effektive indgreb for denne kroniske lidelse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIAAA 1R15AA020996, NIMH R21MH109953, Brain & Behavior Research Foundation NARSAD og NIMHD 2G12MD007592 NMD Cluster tilskud. Vi er også taknemmelige for NIH-finansierede RISE program (NIGMS 5R25GM069621) for at støtte NMD og CMS, UTEP COURI-OVERGÅR program for støtte NMD, NIH-finansierede MARC program (NIGMS 2T34GM008048-31) for at støtte AA, og Dr. Keelung Hong Graduate Fellowship for at støtte EBS. Vi sætter stor pris på UTEP kommunikationsafdeling: Darlene Barajas, Christian Rivera, Karina Moreno, Jose Loya Fernandez og Musik afdeling: Stephen A. Haddad for deres hjælp i videoen og voice-over produktion. Endelig er vi meget taknemmelige for Dr. Andreas Thum for at dele tβh mutant i Canton-S baggrund sammen med kontrol Canton-S fluer; og Jessica Burciaga for hendes værdifulde bidrag til de indledende undersøgelser af octopamin og Han lab medlemmer til diskussion og støtte.
95 % Ethanol | VWR Chemicals | BDH1158-4LP | |
Canton-S | – | – | wild-type strain used as a control |
Copy stand with arms | Kaiser | 205411 | model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station |
Cotton rounds | Swisspers | COT-027 | to deliver ethanol |
Excel | Microsoft | – | to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used |
Fluorescent light bulb | Lights of America | 7108N | maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station |
Microsoft LifeCam software | Microsoft | – | version 3.60; to videotape flypubs |
Microsoft LifeCam Studio | Microsoft | Q2F-00013 | 1080P HD sensor; to videotape flypubs |
Minitab 17 | Minitab | – | version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used |
Nylon mesh sheet | Sefar Nitex | – | model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub |
Petri dishes | Falcon | 08-757-100A | 35 x 10 mm; to deliever ethanol |
Plastic funnel – mid size | Fisher scientific | 10-348A | 65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial |
Plastic funnel – small | Fisher scientific | 07-202-121 | 4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub |
Polycarbonate sheet | Lexan | – | 0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub |
Round-bottom bottle | Fisher scientific | AS115 | polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub |
Soldering iron | Weller | WES51 | to make a hole in a flypub |
Time code | – | – | .smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used |
Tyramine b hydroxylase (tbh) | – | – | mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tbh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany) |
VLC media player | VideoLAN | – | version 3.0.8; any media player can be used to score courtship |